プライマー

シークエンスする前に行うPCRと、ただ断片を増幅させるPCRでは同じプライマーを用いてはいけないのですか？また、シークエンス用のプライマーの濃度を薄くするのは、シークエンスの邪魔にならないようにするためなのですか？
初歩的な質問ですが、宜しくお願いしますm(__)m

No.3 ベストアンサー 回答者： takumicchi 回答日時： 2004/01/13 00:53

結論から言ってプライマーはシークエンスだろうと、単なる増幅だろうと両方に使えます。

もし、2000ベースや3000ベースの遺伝子をPCRで増幅しクローン化したらどうしますか？PCRしてクローン化したら配列確認するのが基本です。DNAポリメラーゼのフィデリティーが高くても100%正確ということはありません。ベクター由来のプライマーだけでは到底全ての配列を読むことは出来ません。

なので400-500ベース間隔で自分の読みたい遺伝子のプライマーをデザインします。配列特異性（あまり短いと似たような配列にアニーリングする可能性がある）とTmを考えると20-30merぐらいが良いでしょう。

No.6 回答者： mizu_atsu 回答日時： 2004/01/14 20:48

質問の本題とは少し離れてしまいますが、シークエンス関係でちょっと追記を。

ayubatakeさんは多分学生だと思いますので知識のひとつとして知っていて損はないと思います。

takumicchiさんの言う通り制限酵素でサブクローニングする方法はちょうどいいところに制限酵素サイトがないと話になりません。そのため自分でプライマーを作るというのはある意味合理的かもしれません。しかし、私が知るサブクローニング法としてもうひとつあります(私自身は使ってません。先輩がやっていました)。それはディリージョン(Deletion)です。これはDNAを末端から分解する酵素(エンドヌクレアーゼだったかな?)でインサートを片側から削って分解し、それをセルフライゲーションさせて読みたいところがプライマーの近くにくるようにする方法です。これを繰り返せば理論上どんなに長いインサートでもユニバーサルプライマーだけで読むことができます。といってもこれだけですべてを読むのは大変です。サンプルを作るのもひと手間かかりますからね。いくつかの方法を組み合わせて効率よく実験してください。

なお、私の読んだ配列はすさまじくGC含量の高い酵素でした。そのためピークが非常に重なりやすく配列を読むのには相当苦労しました。きれいに読むには泳動条件も重要です。尿素含量の高い変成ゲルを使ったり、泳動するときの温度を上げたりすることも必要なことがあります。
余談ですがLi-Cor L-4000は最高で1,000ベース読む事が可能です。HITACHI 5500Lは最高で600ベース位。ただ、シークエンサーにも得手、不得手があります。ひとつのシークエンサーだけでは厳しい場合もあります。可能なら使う機器も検討してみてください。学校なら共用の機器もあったりしますから。

横道にそれてしまいましたがに本題の回答は♯1に書いた通りです。それでは研究頑張ってください。

No.5 回答者： takumicchi 回答日時： 2004/01/14 01:09

mizu_atsuさんの言う通り制限酵素でサブクーローンすればユニバーサルプライマーだけで読めますね。

ただ、私はそういう方法はしたことありません。確かにプライマーが変れば条件は変ってきます。しかし、プライマーのTmをある程度同じになるようなデザインをしてあげれば、大きく反応条件がずれる事はありません。それと、必ずしも、ちょうど良い制限酵素サイトが読みたい配列内に有るとも限りません。そういうタンパクはいっぱいあります。マイナーな制限酵素を買う方がお金がかかります。

幸運な事に私の所属していたラボは、それなりにお金があり、プライマーの外注をためらう事はありませんでした。使用していた遺伝子の配列も読み易い配列だったのかもしれません（超好熱菌の遺伝子をクローニングして配列を読んだ時も問題ナシでしたけど）。

サブクーローンはステップが増える分、時間と労力が必要です。急を要するなら自分でデザインしたプライマーでやった方が確実に早いです。ちなみに私が使ってたシーケンサーはABIの377と310です。

所属するラボの経済状況や周りの人がどうやって配列を呼んでいるのかを聞いてみたらいかがでしょう？
それぞれのラボの方針というのもあると思いますよ。

No.4 回答者： mizu_atsu 回答日時： 2004/01/13 22:46

追記します。

シークエンスプライマーを使用する利点は2つあると思います。1.サイクルシークエンスの条件が少なくてすむこと。
2.プライマーの種類が限られるのでコストが安くなること

1はちょっと考えればわかることですが、プライマーが異なればアニーリング温度などが違ってきます。よって、最適な条件は違ってきます。また、読みたい配列に寄っては(GC含量が高いときなど)サイクルシークエンスの条件を微妙に変えたりします。プライマーの数が多いと条件の選定作業も多くなり非効率的となります。

2も当たり前のことですが安くなります。ただ、最近は任意のプライマー合成も安くなってきているので大したメリットはないかもしれませんが少しは安くなるでしょう。

あと、長い配列を読むときですが、それはサブクローニングすればいいだけのことです。制限酵素地図を作ればどの酵素を使えば効率的にできるかは簡単にわかります。私はベクターとして2～3種(SK+,-,pUC19)、プライマーとして6種(SK、pUCそれぞれについてHITACHIのシークエンサー用に、SKに使うLi-Corのシークエンサー用)を使い9kb位読みました。※といっても本当に正確に読んだのは4kbb位ですけどね。

No.2 回答者： kexe 回答日時： 2004/01/13 00:34

使えないことはないと思いますが

シーケンスで読める最初の方の配列ってピークがかさなったりして
綺麗に読めないことはありませんか？
それをさけるためにもベクターのなかの
プライマー領域を使うとよいと思うのですが

No.1 回答者： mizu_atsu 回答日時： 2004/01/13 00:10

＞シークエンスする前に行うPCRと、ただ断片を増幅させるPCRでは同じプライマーを用いてはいけないのですか？

うーん。使えるとは思うけど。シークエンスするときはベクターに入れると思います。そのベクターにはシークエンスプライマーの結合領域があるのですから、それを使うのが無難だと思います。

＞シークエンス用のプライマーの濃度を薄くするのは、シークエンスの邪魔にならないようにするためなのですか？

濃度を高くしすぎると塩基が不足して短いものの割合が増え、結果として長く読めないような気がします。あと非特異的な結合が増えると思います。