大腸菌を使った実験における注意点

今度遺伝子導入の発現とタンパク質の生成の実験をやるのですが、大腸菌内で異種遺伝子を大量発現させるための注意点を知りたいのですけど何かありますか？
自分は大腸菌の酵素が遺伝子の発現調節に関わる塩基配列を認識しないからなのかなと考えてますが、正しいのか確信がもてません。
どなたか教えてください。

No.2 回答者： takumicchi 回答日時： 2004/12/19 02:54

注意点

・使用する発現システムを理解すること
・発現・精製の原理と手順を理解すること
・発現させるタンパクの性質をわかる限り調べること



>自分は大腸菌の酵素が遺伝子の発現調節に関わる
>塩基配列を認識しないからなのかなと考えてます
>が、正しいのか確信がもてません。
ここの意味がわかりません。
普通大腸菌で発現させるさせる場合は
大腸菌で転写・翻訳がいくようなベクターに
目的遺伝子を入れるはずです。
一般的に売られている大腸菌発現システムを
使用すれば発現はするはずです。
ただし、発現量が低かったり、フォールディングがうまくいかなかったり、不溶性になったりすることはあります。

いずれにせよやってみなければわかりません。
その後で条件検討しましょう。

この回答へのお礼

回答していただきありがとうございます。
とりあえずあげてもらった注意点を考慮しながら、
実験をしてみようと思います。

お礼日時：2004/12/19 11:55

No.1 回答者： Freeuser 回答日時： 2004/12/19 00:18

普通大腸菌にタンパク質を大量発現させるときは、大腸菌のプロモータの直下に目的タンパク質のORFをつなげるんではないかと思います。

ということで、
＞発現調節に関わる塩基配列を認識しない
は確かにその可能性は十分なのですが、今回の場合は問題にはならないというか関係ないでしょう。

元の生物が何なのかは明記されてないようですが、真核生物なのであれば、原核生物である大腸菌とはコドンの使用頻度が異なりますので、下手するとタンパク質が最後まで作られずに途中で切れてしまうかもしれません。

あとは、ペプチドはとりあえず最後までできたんだけれども、シャペロンの違いなどによって正常な折りたたまれ方をされずに、精製しようとしても機能しないタンパク質になっているかもしれません。

あとは、その遺伝子の発現によって大腸菌が致死とならないことかな。

この回答へのお礼

どうもありがとうございます。
元の生物が明記されていなかったもので、原核生物と真核生物の違いのことかとも考えていましたが、
勉強不足でした。
もう少し調べてみようと思います。

お礼日時：2004/12/19 02:07