大腸菌の形質転換を利用したクローニング

先日実験で、大腸菌の形質転換を利用したクローニングを行いました。

集菌と科学的処理
(1)大腸菌の培養液を氷上で冷却した。
(2)培養液5 mLを遠沈管に移し、3000 rpmで5分間遠心した。
(3)大腸菌のペレットを崩さないように上側にして、培養液の上澄みをデカントして捨てた。
(4)あらかじめ冷やしておいた形質転換用溶液（TSS）500 nLにDMSOを25 nL入れて、混ぜた。
(5)(4)を500 nL加えた。
(6)ボルテックスで穏やかに撹拌して、ペレットを縣濁した。
(7)懸濁液を100 nLずつエッペン管に分注して、形質転換に用いた。
(8)ライゲーション反応のDNA溶液を5 nL加えて、指先で軽く撹拌した。
(9)氷上に14:05～14:25頃まで放置して、DNAを取り込ませた。

寒天培地への植え継ぎ
(1)DNAを取り込ませた大腸菌に500 nLのLB培地を加えた。
(2)37℃で15～60分インキュベートして、抗生物質耐性遺伝子が活性化するのを待った。
(3)別の遠沈管に大腸菌を50 nL移し、BL培地を250 nL加えかさあげした。
(4)それぞれの遠沈管に40 nLの100 mM IPTGと40 nLの40/mL X-galを加え、軽く撹拌した。
(5)100 ng/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地2枚に、それぞれの遠沈管の大腸菌を撒いた。
(6)滅菌したスプレッダーで水気がなくなるまで満遍なく広げた。
(7)37℃の気相インキュベーターに入れて、一晩放置した。

このような手順で実験を行ったのですが、全くコロニーが出来ませんでした。
なぜでしょうか？
よろしくお願いしますm(__)m

No.2 ベストアンサー 回答者： AUGQX-MAN 回答日時： 2005/06/12 19:50

この実験はプラスミドを使用したクローニングでしょうか？私が読んで気になった事を箇条書きします、

（１）大腸菌の量は吸光度計で測定しましたか？多すぎても、低すぎてもダメです。
（２）大腸菌の培養液は１０分以上と十分に冷却しましたか？
（３）ボルテックスではなく、ピペッチングでペレットを優しく撹拌して下さい。
（４）氷上でＤＮＡを取り込ませて２０分した後、４２度のインキュベーターやウォーターバスで３０～４５秒間ぐらいの熱ショックを与え、すぐ氷上に戻して急冷してから、３７度でインキュベートしましたか？
（５）Ｘ－Ｇａｌの溶液は遺伝子組み換え大腸菌の培養液に加えるのではなく、同量をＬＢ寒天培地に広げるだけで良いです。これでも十分に青色が発色します。（３７度でインキュベートしている間に、行えば良いです）
（６）遺伝子組み換え大腸菌は水気がなくなるまで満遍なく広げると言うよりも、コンタミを防ぐため１００μｌをパッパと広げる方が良いです。

このように改善すれば、上手く行くはずです。念のため、ポジティブコントロールも同時に行う事を勧めます、（Ａ）トランスフォーメーションだけしなかった同じ大腸菌を、抗生物質のない寒天培地にまく。
（Ｂ）切断やライゲーションを行ってないＤＮＡ断片（抗生物質耐性遺伝子やガラクトシダーゼ遺伝子のみ入っているもの）をトランスフォーメーションした大腸菌を、抗生物質の入っている寒天培地にまく。
（Ａ）でコロニーが出来てなければ大腸菌に問題がある、（Ｂ）でコロニーが出来なければ取り込ませるＤＮＡに問題がある、という事が分かります。
また補足質問があれば、回答します。

この回答へのお礼

学生実験の担当の先生がうちの研究室の先生であったので、やり直しをしたのですが、（１）（３）（６）を改善したところ、うまくいくことができました！ありがとうございました！一番の原因はボルテックスにあったような気がします(>_<)

お礼日時：2005/06/20 14:53

No.4 回答者： toranekosan 回答日時： 2005/06/13 22:42

あとは、大腸菌の種類とベクターの種類は正しく取り込めるものであるか。

そのベクターはアンピシリン耐性か？大腸菌を巻く時のスプレッダーは熱しすぎなかったか?実験実習なのかな?研究室に入りたての実験かな？コントロールとして、アンピシリンが入っていないLB培地にまいた場合はコロニーは出来なかったのかな?このコントロールにいっぱい大腸菌が入ってなかったら、形質転換がうまくいかなかった事がわかりますよ。

No.3 回答者： geneticist12 回答日時： 2005/06/13 01:09

実習ですか？それなら、先生がうまくいくかどうか確かめているはずなので、プロトコール自体には問題が無いとして、

1）ライゲーションがうまくいっていなかった。操作を加えていない、標準的なプラスミドでコントロールはとりましたか？それでも、ぜんぜん出てこなかったのなら、
2）大腸菌の問題。たとえば、コンピーテント（形質転換可能な状態）になっていなかった。大腸菌の培養の状態（培養時間が著しく長すぎたなど）、試薬を加えて準備する段階の操作（操作中に温度があがってしまったなど）に問題があった（TSS法は、たしかヒートショックしなくていいはずだし、プロトコールになかったのなら、関係ないでしょう）。

また、全くだめだったのではなく、想定より著しく効率が悪かったという可能性もあります（ふつう、全くゼロということはまず無い）。まく大腸菌の量をうんと増やしたらいくつか出てきたかもしれません。

いずれにせよ、トラブルの原因追求は、各ステップごとに適当なコントロールがないと無理です。なにかコントロール実験はやっていましたか。やっていないとしても、同じ材料、または別の材料を使って、うまくいっていた人がいたなら、どこが同じでどこが違っていたか、考えてみるとヒントがあるかもしれません。
もし、だれもうまくいっていなかったとしたら、、、実習担当の先生の責任です。

この回答へのお礼

学生実習です(>_<)全部の班が失敗したので、理由がイマイチ分からなくて・・・
ありがとうございました！

お礼日時：2005/06/20 14:49

No.1 回答者： nitscape 回答日時： 2005/06/12 19:16

何のDNAを入れたかによってコロニーがでないことがありますが、きちんとやっていればコロニーはでるはずです。

なぜコロニーができなかったかというのは自分の実験ですからその当時の手順を思い出して自分で考えてレポートにまとめるべきです。課題は自分でやりましょう。

＃「nL」はおそらく間違えだと思います。