No.2ベストアンサー
- 回答日時:
質問はSDS-PAGEでよろしいのでしょうか?
ウェスタンの話のようにも思えますが、一応表題のSDS-PAGEでの話として回答してみます。
一つ一つ可能性を考えて見ましょう。
1.サンプル:以前出ていたのでしたら、変性などが考えられませんか?分解された、腐ったなど。
2.ゲル:市販のゲルでしょうか?低分子量のタンパクでしたらもう少し濃度の薄いものを使っても良いですが、市販のものでしたら変える必要は少ないと思います。
3.loading bufferは一度市販のものを使っても良いかもしれませんね。 NP0004 INVITROGEN NP SAMPLE RED AGT 10Xを使用している場合、NUPAGE ANTIOXIDANTなどを入れ忘れていませんか?
4.電圧、時間:マーカーはきちんと流れていますか?そうでない場合は電源に問題があるかもしれません。
5.染色:ここでもマーカーは染まっていますか?何で染めているかによりますが、CBB染色などの場合、ここでマーカーが染まらなければloadingに問題があります。
ご参考になりましたら幸いです。
この回答へのお礼
お礼日時:2005/07/06 06:23
ありがとうございます。マーカーはきちんと流れています。電気泳動時にBPBの青い線が半分より下方ではレーン毎に曲がってしまっています。いろいろな可能性をさぐってみます!
No.5
- 回答日時:
#2です。
#4さんの補足を少々。
もしもウェスタンのトランスファーで低分子のすり抜けが心配なら、トランスファーメンブレンを2枚重ねてトランスファーしてみてはどうでしょう?過去にそうやって確認したことがあります。意外とすり抜けもある印象でした。
SDS-PAGEでCBB染色はしていますか?まず15kDaのタンパクがあることを確認するのはどうでしょうか。ウェスタンなら抗体の再利用はしない方針の教室もある位ですから再度調整しなおして見ましょう。
No.4
- 回答日時:
SDS-PAGEに問題があるとすれば、他の回答者さんがお答えになった対処法方が適切だとおもいます。
加えて、補足にあったように非特異的なバンドはこれまで同様にしてきれいに見えているのだとしたら、ウェスタンについても対処する必要性があるかもしれません。
1:可能性として、使用している抗体の抗体価が低くなってしまっているかも知れません。何度も使用しているうちに抗体が古くなってしまっているなどの原因が考えられます。この場合、予測される結果の一つとして、特異的バンドは検出されずに、非特異的バンドのみが見られるという状況になり、質問者さんの状況に似ている様に思います。新しい抗体液を使ってみて下さい。
2:転写に注目すると、考えられる可能性は2つあります。1つはゲルが固いので転写されにくくなっていること。故に目的タンパク質がメンブレンへ十分転写されてない可能性です。この場合はゲルを緩くするかSDSを加えると解消されると考えられます。しかし、高分子量がうまく転写されていることを考えると原因としては薄いです。次に、低分子量なので逆に転写され過ぎてメンブレンをタンパク質が通り過ぎてしまった可能性です。この場合は、転写の際の電流を調節してみて下さい。いずれの場合も、転写後のSDS-PAGEゲルをCBB染色してみると原因がつかめます。転写されにくいことが原因の場合はゲルにバンドがハッキリと出ますし、転写され過ぎている場合にはゲルにバンドが無くなっているのに抗体反応ではバンドが検出されないという結果が得られると思います。
以上、ウェスタンに原因があると考えると、現時点では2つが思いつきました。参考になれば幸いです。
No.3
- 回答日時:
ここ数週間、ということは、暑くなってきてからとも考えられますね。
とすると、泳動時の温度が上がりすぎてしまっていることも考えられます。対策としては、
・低温室で泳動する
・泳動の電流(電圧)を低めにする
・冷却パイプつきの泳動槽を使う
などが考えられます。
一番手軽なのは、電流を下げて、ゆっくり泳動することでしょうか。
あとは、泳動バッファーの濃度・希釈倍率などを間違って濃すぎるものを使っていても、過電流による過熱があるかもしれません。
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
似たような質問が見つかりました
- 政治 コロナワクチン(遺伝子注射)を接種すると目の毛細血管を詰まらせて失明したりします。遺伝子ワクチンの接 3 2022/08/28 19:19
- 病院・検査 学校の健康診断で尿糖+と診断されたので市販の尿糖蛋白検査薬を使ったところ尿糖は色が変わらなかったので 3 2023/06/06 17:48
- 環境・エネルギー資源 牛のゲップは温室効果ガス 5 2022/11/26 18:54
- 妊娠・出産 現在妊娠7ヶ月目です。さっき何気なく母子手帳を見たら今回と前回2回連続尿蛋白がプラスでした。血圧は基 1 2023/01/12 11:38
- 泌尿器・肛門の病気 以前に尿路結石、膀胱炎を続けて発症しました。 半年ぐらいたった今でも検尿の結果がよくないです。 そこ 1 2022/04/01 21:20
- 筋トレ・加圧トレーニング 筋トレを30分~1時間しか行わない場合も筋トレ直後にプロテインを飲んだ方が良いのでしょうか? 6 2022/09/04 18:17
- 食べ物・食材 おいくて健康に良くて糖尿病も悪化せず、手軽な値段の酒のつまみや料理は何があるでしょうか 8 2022/06/09 12:25
- その他(病気・怪我・症状) 大腸の鼠径ヘルニアを自力で治せる方法は、今ではおじぎ療法とかあるようですが、栄養管理もまた大切ですか 1 2023/04/29 04:46
- 血液・筋骨格の病気 血液検査(白血球と血小板数値高い) 2 2022/08/12 00:52
- その他(言語学・言語) 団子の語源は中国語の蛋糕(ダンガオ)ではないでしょうか? 3 2023/04/15 18:37
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
-
エチジウムブロマイドを触って...
-
膜タンパク質の結晶化が難しい...
-
「ドミナントネガティブ」
-
グアニジンはイオン交換カラム...
-
SDS-PAGEで分離したタンパク質...
-
タンパク質の収率
-
凍結乾燥の失敗について
-
SDS-PAGEの分子量
-
可溶性画分と不溶性画分について
-
SDS-PAGEで、ゲルを作製すると...
-
頭骨標本の脱脂用に使っている...
-
沈殿の正体は?
-
精液について
-
アルカリSDS法におけるDNAと...
-
なぜ大腸菌はグルコースとラク...
-
吸光度比
-
電気泳動でバンドが出ない理由...
-
サテライトコロニー?について
-
kcatを求める問題について教え...
-
鬼滅の刃についてです ここで産...
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
-
ただしいデカントの方法
-
エチジウムブロマイドを触って...
-
SDS-PAGE 移動度について
-
プラスミド精製の原理
-
タンパク質の収率
-
凍結乾燥の失敗について
-
SDS-PAGEで、ゲルを作製すると...
-
どうしてもエタノール沈殿が上...
-
頭骨標本の脱脂用に使っている...
-
SDS-PAGEで分離したタンパク質...
-
可溶性画分と不溶性画分について
-
シトクロムcについて・・・
-
エチブロが妊娠に与える影響に...
-
Western blotting -バンドがす...
-
PD-10カラムを用いた抗体精製法
-
アガロースゲル電気泳動の失敗
-
プラスミドDNAを抽出する時のス...
-
検量線について
-
タンパク質の分子量測定、なぜ...
-
native-PAGE
おすすめ情報