No.2ベストアンサー
- 回答日時:
FIVのシュードウイルスベクターからコロニーPCRで500~600bpのフラグメントをExTaqで増やして、
またはFIVのシュードウイルスベクター6~7KBを精製して、
それらをテンプレートにして
ABI3300とBigDye terminator Ver.3.1で読んでいます。
調子がいいと800bpくらいまで読めます。
310NTも同じくらい読めると思いますので、
いいプライマーとテンプレートがあれば、
4つくらいプライマーを設計すれば読めるのではないでしょうか。
LTR部分がテンプレートにあっても、
その部分はプライマーにしない方がいいです。
ダブルピークになり読めませんでした。
でも、FIVってRNAウイルスですよね。
テンプレートはどこから調整するのでしょうか。
ネコのゲノムから直接
(もしくはPCRで一回増やした溶液をテンプレートにして)
読むのは無理な気がします。
プラスミドなどにクローニングして大腸菌にいれて、そこから読むにしても、
一度PCRで目的のフラグメントを増やしてからの方がいいと思います。
http://www.shimadzu-biotech.jp/datahall/dsq/dsq0 …
私はExonucleaseとSAPは使わずに読めています。
この回答への補足
回答ありがとうございます。
FIVが細胞に感染すると、ウイルスRNAがDNAに逆転写されて細胞のDNA中に組み込まれ、プロウイルスという形で存在するようになります。私は、FIV感染細胞からDNAを抽出し、目的部分のPCRをして、それをテンプレートにしてシークエンスしようと考えていたんですが。
No.3
- 回答日時:
もしかしたらそのまま読めるのかもしれませんが、
FIV由来のDNAとゲノムDNAをどのくらい分けて精製できるのかが
私にはわかりません。
SNPsやメチル化の解析では
nested PCRでゲノムのコンタミを減らして
直接読んでいるので、
そちらを参考にされてはいかがでしょうか。
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