形質転換導入ベクターの大きさの限界？

コンピテントセルDH5αを使って形質転換を行っているのですが、おそらく導入ベクターが大きすぎるせいで、上手くトランスフォーメーションが成功しません。
PcoldTFベクター(約4500ｋDa(?))に目的遺伝子(約1000ｋDa(?))を組み込んだ導入ベクターなのですが、コンピテントセルにはどれくらいの大きさのベクターまで導入できるのでしょうか？
また、大きいベクターでも導入可能な方法などあれば教えて頂けないでしょうか。

拙い文章で申し訳ありませんが、ご教授お願いいたします。

No.1 ベストアンサー 回答者： geneticist12 回答日時： 2006/10/30 20:40

コンピーテントセルにプラスミドを導入する効率は、プラスミドサイズが大きくなるほど低くなりまが、10 kbより小さい範囲ならば、サイズ増加による効率の低下はそれほどでもありません。

しかし、10 kbを越えるあたりで急激に一桁くらい下がります。それでも、20 kbくらいまでならケミカル法による形質転換は可能です。

それより大きくなるとケミカル法では難しく、electro-porationを採用するべきでしょう。electro-porationなら、たとえば100 kbくらいのBACベクターを入れることもできます。

4500+100 kDaなら8 kb前後でしょうか。electro-porationが使えるなら効率を上げることがでしょうが、ケミカル法で十分いける範囲だと思います。

この回答へのお礼

早速の回答ありがとうございます。
まず、少し勘違いしていたので質問を訂正させて頂きます。

×＞PcoldTFベクター(約4500ｋDa(?))に目的遺伝子(約1000ｋDa(?))
○＞PcoldTFベクター(約5500bp)に目的遺伝子(約1000bp)

申し訳ありませんでした。

20kbまでケミカル法で大丈夫なら形質転換が上手くいかないのは、ベクターの大きさ以外の理由ですかね？
もしかしたら濃度の問題などかも知れませんので、もう一度方法を検討してみたいと思います。

分かり易い回答ありがとうございました。

お礼日時：2006/10/30 21:03

No.4 回答者： yakyutuku 回答日時： 2006/10/31 03:43

私は１０ｋのインサートをpuc19に（２～３ｋ）入れたのがマックスです。

空ベクターって、切断してライゲーションしたものですか？とりあえずコンピテントセルにまったく関係ないプラスミド入れて、コンピテンシーを確認しましょう。それではえなきゃそのセルは駄目です。（たまに選択培地の薬剤濃度間違えるやつもいますが・・・）それではえるのなら、ライゲーションの失敗の可能性が濃厚です。プロトコールを確認して問題なければ、新しいリガーゼを買って、やり直しましょう。

この回答へのお礼

コンピテントセルやリガーゼ自体に関しては研究室内で共同で使っている物なので、問題は無いと思います。(他の人はコロニーが生えてますので)

抗生物質の濃度も問題は無いと思いますので、やはり僕のサンプル自体のライゲーションや濃度などに問題あるのかも知れません・・・。

もう一度方法を見直してみます。
助言ありがとうございました。

お礼日時：2006/10/31 19:08

No.3 回答者： Dr_Hyper 回答日時： 2006/10/31 03:17

しつこいおっさんですみません。

空ベクターはインサートなしのコントロールですか？それとも何にも切断していない買ったままのベクターということですか？後者だとケッコウ問題ありですよね。
はじめて使うベクターであれば、何も処理していない（制限酵素でカットしていない環状のままのもの）を1pg-0.1ng程度に希釈して同じ方法でtransformationして問題なく予想通りのコロニー数得られるか確かめておくと安心です。時々何にもinsert入れなくても大腸菌の状態が悪くなるplasmidってありますから。pcDNA3なんかは大腸菌の増殖が少し悪くなることがよくあります。

この回答へのお礼

空ベクターと言うのは制限酵素処理で切れ残ったもの等を言ったつもりだったのですが、ただのボヤキみたいなものですのでお気になさらず・・・(＾＾；
誤解を招く様な書き方をしてすみませんでした・・・・。

一度そのままのベクターだけで濃度などを調節してやってみたいと思います。
度々の助言ありがとうございます。

お礼日時：2006/10/31 19:03

No.2 回答者： Dr_Hyper 回答日時： 2006/10/31 01:02

質問を読んでいて疑問がありましたので、ひとつだけ。

pColdTFに1000bpのインサートを導入したもの。というのはご自身がすでに構築し、インサートが入っているものを確認されたものですか？それともligationをしたものを導入したときにcolonyが生えてこないという意味でしょうか。すでにpColdTF-1000bpができているのであれば、少なくとも一度はtransformationできないと構築できないはずですので、大きさやインサートの影響を除外できるのではないですか？

transformaionで時々あるのが、コロニーが少ないなどと思ってplasmidを500ngとか1μgとか入れてしまうヒトがいます。
通常100ng以上のplasmidは通常の作り方で作製したコンピテントセルDH5α50-100μlにいれるとかえって効率を下げてしまい、それ以上になるとコロニーが生えてこないこともありますので注意です。

この回答へのお礼

説明不足で申し訳ありません。
後者のLigationしたものを導入した時にColonyが生えてこないという状況に悩まされています。

空ベクターが導入されたものすら生えてきませんので、セル内にベクターが取り込まれていないのか、もしくはLigationが上手くいっていないのか・・・・。

何にせよもう一度考え直してみます。
助言ありがとうございました。

お礼日時：2006/10/31 02:39