現在、核に局在すると推定しているタンパク質について免疫組織染色解析を行なっています。そこで、あわよくば細胞内局在まで見てやろうと思い、発色後の組織をDAPIで染色して観察しているのですが、どうも免疫染色のシグナルが強い切片ほどDAPIの蛍光が弱いのです。(DAPIは、ネガコンのpreabsorbedで最も良く染まり、次に抗体希釈条件によって免疫染色シグナルが弱いものが染まりやすいです。強く発色させたものでは、前二者で染まっていた細胞でも全くDAPI蛍光が観察できなかったりします。)
そこで、質問なのですが、核にあるタンパク質に結合した一次・二次抗体および標識タンパク質や発色物質によってDAPIの浸透が阻害されるようなことはありえるのでしょうか?
必要そうな諸条件を以下に書きます。
・ブロッキング:10%(w/v) BlockAce, 10%(v/v)ヤギ正常血清 in PBS
・一次抗体希釈液:0.3% PBS-BSAまたはCan get signal solutionA(TOYOBO)
・二次抗体:ビオチン化抗ウサギIgGヤギ抗体
・ABCキット:VECTASTAIN Elite
・発色試薬:DAB(Niは使用しない)
・DAPI染色:1 ug/mlで5 min(遮光)
・封入:余分なDAPI溶液を軽く除いてから、水溶性封入剤VectaMount AQ (VECTOR)、
・遮光して乾燥後観察
No.1ベストアンサー
- 回答日時:
免疫染色のほうも蛍光ラベルのものを使ったらいいと思います。
おそらく、
1. DABの沈殿が励起光をクエンチしている(ベンゼン環をもっていて短波長を吸収しそう)
2. peroxidaseが作り出す過酸化物ラジカルがDNAをアタックして、染色性をわるくする
というような原因(きっと前者)だと思います。
ご回答ありがとうございます。
>免疫染色のほうも蛍光ラベルのものを使ったらいいと思います。
私も免疫染色でQ-dotを使うことを検討していました。早速試してみたいと思います。
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
おすすめ情報
- ・漫画をレンタルでお得に読める!
- ・街中で見かけて「グッときた人」の思い出
- ・「一気に最後まで読んだ」本、教えて下さい!
- ・幼稚園時代「何組」でしたか?
- ・激凹みから立ち直る方法
- ・1つだけ過去を変えられるとしたら?
- ・【あるあるbot連動企画】あるあるbotに投稿したけど採用されなかったあるある募集
- ・【あるあるbot連動企画】フォロワー20万人のアカウントであなたのあるあるを披露してみませんか?
- ・映画のエンドロール観る派?観ない派?
- ・海外旅行から帰ってきたら、まず何を食べる?
- ・誕生日にもらった意外なもの
- ・天使と悪魔選手権
- ・ちょっと先の未来クイズ第2問
- ・【大喜利】【投稿~9/7】 ロボットの住む世界で流行ってる罰ゲームとは?
- ・推しミネラルウォーターはありますか?
- ・都道府県穴埋めゲーム
- ・この人頭いいなと思ったエピソード
- ・準・究極の選択
- ・ゆるやかでぃべーと タイムマシンを破壊すべきか。
- ・歩いた自慢大会
- ・許せない心理テスト
- ・字面がカッコいい英単語
- ・これ何て呼びますか Part2
- ・人生で一番思い出に残ってる靴
- ・ゆるやかでぃべーと すべての高校生はアルバイトをするべきだ。
- ・初めて自分の家と他人の家が違う、と意識した時
- ・単二電池
- ・チョコミントアイス
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
-
染色について
-
顕微鏡で血液を観る為に必要な...
-
試料、標本、sample, specimen
-
酢酸カーミンとアセトカーミン
-
培養細胞のギムザ染色のコツ
-
凍結切片の作成方法
-
ブロッキングに使用するスキム...
-
ImageJを用いて免疫染色陽性率...
-
トルイジンブルー染色とは
-
ショウジョウバエの交雑実験に...
-
染色液について
-
冷凍解凍と冷蔵の食肉の細胞を...
-
遺伝の入試問題
-
ピペットチップ オートクレー...
-
トランスフェクションでの培地...
-
ヨーグルトは腐らないって本当...
-
オートクレーブ121℃15分の意味
-
水にハイターを混ぜると腐らな...
-
IBとWBの違いは?
-
潔癖症です 助けてください ト...
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
-
ImageJを用いて免疫染色陽性率...
-
顕微鏡で血液を観る為に必要な...
-
試料、標本、sample, specimen
-
ヨウ素ヨウ化カリウムの染色
-
細胞核を染色する染色液で家庭に
-
酢酸カーミンとアセトカーミン
-
透明骨格標本
-
免疫組織染色とDAPI について
-
サフラニンでの染色について
-
透明標本を作成する際の固定方...
-
急ぎでお願いします!食用色素...
-
顕微鏡のチャンネルとは?
-
透明標本の、軟骨染色に関して
-
玉ねぎの細胞の染色について
-
エチジウムブロマイド
-
病理組織学のアルシアン青染色...
-
体細胞分裂の実験について
-
小学生が顕微鏡で酵母や乳酸菌...
-
酢酸オルセイン液は・・・
-
凍結切片の作成方法
おすすめ情報