DNAの回収について

GEANCLEAN II KIT を用いてDNAを回収していますが、とても効率が悪くて困っています。効率を高めるような秘訣ってありませんか？説明書的なものでも結構です。

No.5 ベストアンサー 回答者： Nao2 回答日時： 2001/01/18 21:50

GENECLEANって回収悪いですよね。

（うっている会社には怒られてしまいそうですが・・・。）
わたしも、昔やって、うまくいかなかった経験があります。
ガラスビーズが最終的に混ざるし。
もしも、ほかのKITをためす気があれば、QIAGENのQIAEX GEL Extraction Kitをおすすめします。すごく簡単できれいに確実にとれます。
１５０個で２５０００円なので、コストパフォーマンスもまずまずです。

古典的な方法でもよければ、フェノール抽出法でしょう。

１．低融点アガロースで、泳動して、切り出したら（できるだけ小さく切るのがポイント）、３００マイクロリッターになるようにTEバッファーを加えます。

２．６５度で溶けるまで（～１０分）インキュベートして、溶けたらすぐに、等量のTE飽和フェノールを加え、よく混ぜて、１５０００rpm、室温で５分遠心します。

３．上清を新しいチューブに移し、再度、等量のフェノールを加え、よく混ぜて、15000rpm、室温で５分遠心します。

４．上清を新しいチューブに移し、等量のクロロホルム（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加え、よく混ぜて、１５０００rpm、室温で５分遠心します。

５．上清を新しいチューブに移して、1/10の３Ｍ酢酸ナトリウム(pH 5.2)と３倍量のエタノールを加え、-80度、２０分（-20度なら、もう少し長め）冷やして、15000rpm、4度で２０分遠心します。

６．上清を捨てて、７０%エタノール100マイクロリッター加え、再度15000rpm,４度で５分遠心して、上清を捨て、乾かしたら、TEバッファーに懸濁して終了です。

フェノールは手に付けるとやけどしますので注意してください。
この方法はなれればすごく回収率もいいですが、やっぱりおすすめは、QIAGENのKITかなあ。

この回答へのお礼

プロトコルまで書いていただいて、とても感謝しています。
早速、QIAGENについて指導教官と相談してみます。

お礼日時：2001/01/19 14:11

No.4 回答者： akiyamaharuka 回答日時： 2001/01/18 19:42

ライゲーションが上手くいかないのではなく回収段階ですね。

鉄則

上手く出来る人と一緒にやる。
方法やkitを換えてみる。
量だけの問題でしたら。スタートマテリアルの量を増やす。
配列によっては回収率が悪いものもあるのでポジコンで確認を。

ライブラリーの作製ではないですよね。

具体策（簡単に）
加温時間を長く
洗いは慎重に
溶出volを下げることで（同じ回収量だとしても）濃度を上げて、ライゲーション時に高濃度で持っていく。

まわりも駄目な時はビーズが変になっている（原因不明）の場合あり。

わかりにくければ補足要求してください。

この回答へのお礼

二度にわたるアドバイス、ありがとうございました。

お礼日時：2001/01/19 14:18

No.3 回答者： m_nkgw 回答日時： 2001/01/18 11:35

私もGEANCLEAN IIを使って精製していました。

（卒研時）
やはり収集率が悪かったので、ガラスパウダーを洗浄してDNAを回収するループを１回多く回していました。
ただし、最後の１回分は不純物が心配だったので、別に保存し、最初の産物の結果次第で使ったり使わなかったりしていました。
でも、あまりおすすめできませので、収率を上げるためにはKITに頼らないプロトコルをお勧めします。手元にメソッドがないので直接的な資料を提示できませんが、指導教官に相談するか、DNA抽出を専門的に扱っている大学研究室に電話をするかメールをして、代表的なプロトコルを薦めてもらってください。

この回答へのお礼

アドバイスありがとうございます。
でも、DNA抽出を専門的に扱ってる研究室ってうちなんですよね。
しかも大学じゃなくて国立の機関で（笑）
まあ、私の経験不足が一番の原因かもしれないですね。

お礼日時：2001/01/19 14:16

No.2 回答者： you-net 回答日時： 2001/01/18 08:26

以前、卒論でDNA　Seqenceのしていたんですが、dsDNAの単離の際にジーンクリーンを使ったことがあるんですが、回収率が悪く(泳動ゲルから分離すること自体がコンタミの原因だったような)、２．３度試してやめた覚えがあります。

当時のプロトコールを見たんですが、もう５年も前のことで英語のプロトコールを読めませんでした。どうもゴメンナサイ。

No.1 回答者： knightgold 回答日時： 2001/01/17 18:43

　質問なのに質問で返すのは良くないですが、これは大腸菌でＤＮＡを増殖させて

これをキットで回収しているのですか？？

　もしそうならば、　１　大腸菌濃度が濃かったり、薄かったりしている
　　　　　　　　　２　大腸菌君自体の調子が良くない
　　　　　　　　　３　大腸菌中のＤＮＡの増殖が極端に少ないか、
　　　　　　　　　　　多くなっている。
　というのが考えられます。

　次に、プロトコールをもう一度良く読んで実験方法があっているか確認
　しましょう。
　使用するプラスミドの種類によっては、使用する試薬、量、濃度が違ってきま
　すので確認しても良いと思います。あとＤＮＡの長さでも同じ。

　んんーでも一応ＤＮＡは少しながら回収出来ているのだから、回収する物自体が
　やっぱり良くないのでは？？

　昔、植物のＤＡＮを、フェノール抽出法で行っていたのだが、（フェノールが手にこぼれたりして怖かった）、温度とかには注意してましたからね。
　あと鳥のＤＡＮを取っていた時も、核が多い肝臓を使って採取してましたからね。
　
　昔の実験を参考にしました。
　もしよかったらGEANCLEAN II KIT の簡単なプロトコール教えて下さい。
　

この回答への補足

アドバイスありがとうございます。
私の質問が大雑把なため誤解が生じたかもしれませんが、
質問のDNAの回収はライゲ－ションの前の段階で、
ゲルから切り出したDNAを精製する段階のことです。
GEANCLEANはNaIでアガロースを溶解させ、DNAをガラスパウダーに
吸着させて回収する方法です。

補足日時：2001/01/17 19:06