Ｉｎ VitroのKDアッセイについて

Invitroの結合実験でＫＤをとっています。現在とれてきたデータが本当に飽和したスペシフィックなものと判断可能かがわからないのでアドバイスをいただきたく思います。

具体的には、1.5mltubeに25pmolのGSTプロテインをGSHビーズにくっつけて、そこに　10pmolから(反応系1ml)　600pmolのＭＢＰタンパク質を加えています。

バインディングは100pmol程度の濃度（100nM）から飽和に達して、その結合量は飽和した状態で 600fmol（つまり結合比は最大で100対2程度）

になります。

このデザインではフリーのリガンドタンパク質に対して結合しているタンパク質が1000対1程度になるのですが、このような比になっているグラフは論文で見たことがありません。

勿論ビーズにくっつけるタンパク質を増やせば結合量も増えていきますが、　200pmol程度ビーズにくっつけたときは、同様の濃度域で結合が飽和せずバインディングするものが増えていく傾向にあります。

ポジティブに考えればこれは、ノンスペが増えたせいだともとれるのですが、、、

アドバイスをいただきたく思います

No.3 ベストアンサー 回答者： ebikichi 回答日時： 2007/07/10 22:35

＞BoundとFreeを分けて測定？？

誤解を招く表現でした。すみません。
Freeは既知ですので、実際に測定するのはBoundだけです.

＞バッファーによるＷａｓｈが数度入ることで、タンパクが希釈される状態の平衡が、、、、、、、

乖離がそれほど早い場合は、このままではＫｄ値は求められません。
正確に求めたい場合は、タンパク同士ですので、likerを使うとか、対策が必要かと思います。

Ｋｄが最終目的でないなら、おおよそ（100nMで飽和するなら、Ｋｄ＝10nM前後）でいいのではないでしょうか？

この回答へのお礼

何度もご回答いただきありがとうございました。

おかげさまでかなり理解がすすみました。

他の実験結果とあわせて引き続き検討したいと思っています

お礼日時：2007/07/10 22:57

No.2 回答者： ebikichi 回答日時： 2007/07/09 13:33

すみません。

GSTについては詳しくないので、、、

このような実験をする場合、boundとfreeを分けて測定しなければなりません。（FPやFRETですと分ける必要はありませんが）
それをB/F分離といいます。

B/F分離がきちんとでき、ノンスペも十分低いのであれば、boundとfreeが１０００倍差があっても問題はないはずです

それより結合比2-3:100はacceptableですか？

この回答へのお礼

BoundとFreeを分けて測定？？　

Freeのタンパク質の量は、反応に用いたタンパク質の量（あらかじめ定量した濃度と加えた量から算定）から結合したものを引いた値を用いてます。

これでは問題があるでしょうか？

＊＊
実験状況は、

チューブの中にタグ付タンパク質＝レセプター（量固定）　リガンドタンパク質（濃度を振る）、そしてタグタンパク質をPull downできるように　少量のbeadsを加えて、反応させています。

ノンスペを落とすために、遠心法でビーズを回収した後＝当然ビーズにくっつくレセプターもそこにくっつくリガンドも一緒に回収されます

Ｗａｓｈバッファーを加えて攪拌、遠心回収を繰り返します（トータルでビーズの容量の4倍を5回）。

結合リガンドはＳＤＳ－ＰＡＧＥ以降のバンド染色を用いてます

Ｆｒｅｅのリガンドは、スタート時に設定した量から結合したリガンドを引いた値を用いてます。
＊＊

結合比に関してですが、　

ＧＳＴタンパク質をGSHビーズにくっつけてバッジ法で行うバインディングアッセイで求める場合、　いいとこ10対1くらい、　という話を鵜呑みにして判断しています＝論文になったもので、100対4くらいのものもあった。

これは、元の平衡反応の後、バッファーによるＷａｓｈが数度入ることで、タンパクが希釈される状態の平衡が繰り返されることで、理想的な1対1比から外れていってしまうのだと理解しています。

しかし確かに弱いという気はします。

お礼日時：2007/07/09 15:57

No.1 回答者： ebikichi 回答日時： 2007/07/09 01:08

Ｂ/Ｆ分離はきちんと出来ていますか？

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。

B/F分離とはどういうことでしょうか？　

最終的に結合したリガンドタンパク質をＢｏｕｎｄ　として　そこから最初の反応系に加えたリガンドタンパク質を引いたものをＦｒｅｅリガンドとして考えています。

今の条件だと結合しているリガンドの割合は、加えたリガンドの割合に加えて圧倒的に小さいです。（結合が最大で-000fmol に対し加えているタンパク質は000pmolオーダー）

レセプター側の（Ｂｏｕｎｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）/（Ｆｒｅｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の比は　リガンドが飽和する濃度で２－３/１００　です。

お礼日時：2007/07/09 09:42