サブクローニングについて

わたしは今pET15-bへのサブクローニングを行っていますが、なかなかうまくいきません。そこで質問なんですが、pETベクターにはそもそも遺伝子が入りにくいものなんでしょうか。また何かうまくいくコツみたいなものがあれば教えてください。

No.1 回答者： geneticist12 回答日時： 2008/07/22 12:27

ほかのベクターに比べて入りにくい（ligationしにくい）ということはないですが、大腸菌に入れたときに大腸菌が増えにくいということはあります。

そのためにコロニーが生えてこないのではないでしょうか。

大腸菌が増えにくいのは、外来遺伝子からタンパク質が発現してしまい、それが大腸菌にたいして毒性を示すことがあるからです。

宿主菌はなにを使っていますか？ 大量発現の時に使うBL21(DE3)だと誘導をかけなくてもleakyに発現して、大腸菌が死んでしまうことがあるのでサブクローニングには不適です。まず、DH5などpET15からの発現に必要な遺伝子（T7 polymerase）を持たない系統でサブクローニングして、当たりのプラスミドを精製してBL21(DE3)に入れなおすといいでしょう。

この回答へのお礼

有難うございます。発現株はBL21(DE3)を使っています。大変参考になりました。また何かありましたら宜しくお願いします。

お礼日時：2008/07/22 15:04

No.2 回答者： otx 回答日時： 2008/07/22 23:50

＞pETベクターにはそもそも遺伝子が入りにくいものなんでしょうか。

そんなことはありません。

あと、うまくいかない理由で考えられることは山ほどありますが
他の理由を考えたほうがいいと思います。