2つのシークエンスによる結果の違い

PCR後の精製産物をシークエンスするダイレクトシークエンスとクローニングしてプラスミド回収してからのシークエンスの2パターンで配列解析をしました。

するとダイレクトシークエンスはうまく読めたのですが、もう一方のシークエンスのほうは、配列を読めずNと表示されました。

一般的にダイレクトシークエンスは、うまく配列を読むことが困難だということを聞いたことがあります。

今回このような結果になったのは、たまたまなのでしょうか？

またダイレクトシークエンスの長所は、クローニングをしないので短期間でシークエンスが可能。短所は読めない配列が多いと聞いたことがあります。
そこでクローニング済みのシークエンスのほうの長短所って何なのでしょうか？

回答よろしくお願いします。

No.3 ベストアンサー 回答者： sfwaesr 回答日時： 2009/01/31 10:37

こんにちは。

実際の実験では、発現ベクターの構築や変異探しを精査するときにクローニングした産物をシーケンスします。ダイレクトシーケンスでも変異は探せますが、研究者によっては、例えばクローニングされたプラスミドを20個シーケンスして、aggaAaaaが15個、aggaTaaa（配列は適当なのでBlastとかに投げないでくださいね）が５個なので、鋳型はA型が３に対してT型が1存在するという定量をする方もいます。ダイレクトシーケンスでも不可能ではありませんが、１：１ではなく、２：１とか４：１の定量性を見るのは難しいかと思います。

ダイレクトシーケンスは、増えたPCR産物をそのまま読むために、鋳型のある塩基が----taatGc----と----taatCc----が1:1で含まれているとき（ヒトゲノムでは父方と母方の塩基が違うことがよくあります）、次のようなメリットが考えられます。
・（メリット）そのシーケンスの波形はGとCが一対一で出てくるように定量性がややあること
・（メリット）シーケンシング反応はたまにエラーを起こしますが、それはマイノリティになります。正しい配列の波形の方が大きく出るので、鋳型の配列にほぼ一致した配列が読めます。

クローニング済みのシーケンスは、１クローンだけ読むと、その配列がシーケンシング反応によるエラーの塩基置換を含む危険性が高い一方で、
・一見、単一の産物に見えても１塩基レベル、あるいは全体にわたって複数の産物がPCRで増幅されたときに、複数のクローンをシーケンスすることでなにが増えたか調べられます。ダイレクトシーケンスではこれは難しいです。
・（先の方も書かれていますが）基本的には単一のプラスミドの配列を読むため、シーケンスがきれいに読めるはずですし、その後の応用（発現用のベクターに入れる）にはプラスミドでの塩基配列の正しさの確認が必要です。

クローニングしたプラスミドを読む場合はインサートの長さにもよりますが、最低３個くらい読んだ方が良いと思います。

プラスミドのシーケンスがうまくいかなかったとのことですが、制限酵素で確認されたのことでものは入っているのだと思います。シーケンシング反応はエタ沈がちょっとマズイだけでシーケンスが読めなくなったりするので、もう一回同じ事をやると読めるようになるかもしれません。
シーケンシングプライマーですが、プラスミドにあるシーケンシングプライマーの配列（T7, SP6, M13など）が実は、シーケンシング反応に有利な配列でないことがあります。最近は合成オリゴの値段も安いので、「同じ配列を複数読む」ようなことであれば、自分の入れたインサートにある配列でシーケンスされるのがよいと思います。「中から外に読む」感じです。もし、サイズが500bpとか小さいようならPCRで増やしたときに使ったfowardとreverseプライマーで網羅できるでしょう。
あと、ご存じと思いますが、シーケンス反応に持ち込むプラスミドとPCR産物の至適な量が違うので、そこの確認をされても良いかと。

また、制限酵素処理の代わりに、拾われたプラスミドを一度50uLのLBに移して、そのうちの1uLを鋳型にコロニーPCRなどでインサートの有無を確認して、インサートの入ったものだけを増やすとたくさんのコロニーをカルチャーしなくて済みます。

がんばってくださいね！

No.2 回答者： RNase_P 回答日時： 2009/01/28 17:18

クローニングしてから調製したプラスミドは

基本的に均質なものと考えられます。
それに対してPCRダイレクトシーケンスの場合、
PCRの非特異的増殖や増幅時の変異などにより
鋳型自体が均質とは言えません。
そのためシーケンスの波形データ自体の質は劣ることも多いと思います。

配列既知のもののサブクローニングでは問題になりませんが
新規配列の解析の場合、クローニング経由の場合1クローンの
配列が綺麗に読めたからと言って、それが"正しい"配列だ
と言うことにはなりませんので気をつけてください。

No.1 回答者： RNase_P 回答日時： 2009/01/27 21:01

まず第一の質問についてですが、

一般的にクローニングに用いられるベクターを使用しているのであれば
ベクターが原因で読めないと言うことは考えづらいですので、
インサートが入っていない、
プラスミド調製に失敗しているもしくは濃度が足らない、
プライマーの設計ミス、入れ間違い、プライミングサイトの欠損
などが考えられると思います。
それぞれの段階できちんと確認されてますでしょうか?
サンプル数が少ないのであればたまたま実験操作に失敗した可能性も
高いですのでやり直してみるのも良いと思います。

ただ配列が知りたいだけでしたらPCRダイレクトシーケンスで十分です。
配列を確認したのちに何か別の実験に用いるのでしたら
通常クローニングすることが多いでしょうから
その意味では二度手間が省けるというメリットがあります。

この回答への補足

プラスミド回収後に制限酵素処理しインサートは確認しました。
プライマーの配列がR側からしか含まれていないサンプルもあったので、入れ間違い考えられますね。

ただ配列を知るための実験です。
その場合クローニングしても手間がかかるだけなんですね。
ダイレクトシーケンスはクローニングしたものに比べ誤読が多いと聞いたことがあるのですが、実際どうなんでしょう？

補足日時：2009/01/28 10:55