No.1ベストアンサー
- 回答日時:
その融合タンパクで何をしたいのか解りませんので明確な答えにはなりませんが、まず1)お書きになっているようにNaClの濃度をおよそ1-1.5Mにして溶出することを試みます。
2)もし、うまく行かなかったらChaotropic試薬例えば尿素(6M)あるいはグアニジン(4M)で溶出します。しかしながら(2)の方法ですと3次元構造は壊れますので注意してください。収量は少なくともできるだけNativeなものが欲しければ(1)を採用します。(1)、(2)双方とも透析で塩を除きますが透析膜のMWCO値に注意してください。また、溶出バッファーにTriotonをいれても大して効果はありませんし、後からTritonを除くことはほぼ不可能に近いですのであまりお勧めはできません。SDSも同様です。さらに樹脂にロードする融合タンパクの量が多すぎるとアグってしまい樹脂から出なくなりがちなので「たんぱく量と樹脂の比」も重要な検討課題だと思います。Thrombinで切断する前にどのような条件で樹脂を洗っているか、そのバッファー組成の検討も大事です。
No.2
- 回答日時:
GSTビーズがカラムにつめられたものをお使いでしょうか?(カラム法とか言ったりする方法でしょうか?)
それだとアグってしまうと(本当にアグっているとして)もうカラムの中には手出しが難しいので
単純に、GSTのビーズを15mlのチューブ内でGSTタンパク質と結合させたり、洗ったりして
(ビーズは遠心して集める)精製を行なえばいいのではないでしょうか。
(バッチ法とか言ったりする)
その後、タンパク質が結合しているはずのGSTビーズを15mlのチューブ内で
トロンビン溶液を作用させれば良いんじゃないでしょうか?
このとき、本当にタンパク質が切断によってアグってたとしても
チューブ内だったら見てると何らかの変化が観察できるかもしれませんし、
このとき、うまくやるとビーズを沈殿させるのと、アグったタンパク質の沈殿を
異なる遠心力で分けることができるかもしれませんし。
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