SDS-PAGEの染色について

クマシー染色で、バンドが全く染色されません。マーカーだけがいつもあるだけで後は透明です。何が原因なのでしょうか？サンプルとしては、液体培養で育てたカビの体外分泌タンパクで、上清をTCA沈殿やアセトン沈殿で40倍ぐらいに濃縮して使ってます。

No.3 ベストアンサー 回答者： rainyday 回答日時： 2004/06/06 21:01

先にご指摘のあるとおりだと思います。

タンパク濃度が測れるのならば測定してみてください。
体外分泌ですと、非常に微量だと思いますので、濃縮して十分量のサンプルを乗せて泳動してみてはいかがでしょうか？

また、＃２の方がおっしゃっている通り、銀染色も視野に入れるといいと思います。クマシルよりも感度が高いので、きれいな条件でやらないといけなくなりますが、微量なタンパクの検出には非常に有効です。
銀染色のキットもたくさん出てますので、一度お試しになってください。

タンパクの実験は条件設定が大変ですが、頑張ってくださいね！

参考URL：http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/qa/gn9.htm

この回答へのお礼

サンプルをさらに濃縮したり、やり方を変更したら、多少改善されました。銀染色も視野にいれてやっていきたとおもいます。

お礼日時：2004/06/21 15:32

No.4 回答者： fujishiro 回答日時： 2004/06/06 21:50

みなさんと同じ指摘なんですけど、タンパク定量はできませんか？

染色はどれぐらいしてますか？
例えばマーカーの量が多くて、マーカーが染まったからといってまだタンパクがきちんと染まっていないというのは考えられませんか？
染料は十分ですか？

また最近はキットで同じ染色方法などでも感度がだいぶ上がっているものも発売されていますので、そういうもので確かめられるのもいいかもしれませんね。

あとはゲル全体を染めていますか？必要なとこだけ切って染色することもありますが、予想と全然違うところにタンパクが出ていることもあるかもしれません。

この回答へのお礼

研究室で何度も同じ試薬を使っていたので、全て作り直したらうまくいきました。アドバイスありがとうございます。

お礼日時：2004/06/21 15:30

No.2 回答者： noname#7004 回答日時： 2004/06/06 19:42

考えられるのは

・本当にタンパクはある？
・ゲルの濃度は適当？
・クマシー染色時間を長くする
・脱色が不十分？
くらいです。
とりあえずしっかり脱色したクマシー染色後のゲルを
水か銀染色の最初の液で一晩振盪させて、
銀染色で確認してみたらどうでしょう。
100倍感度がいいので、
タンパク質があるなら検出できると思います。

この回答へのお礼

一度試してみます。ありがとうございました。

お礼日時：2004/06/21 15:33

No.1 回答者： mizu_atsu 回答日時： 2004/06/06 19:32

＞バンドが全く染色されません

とありますが、そもそもバンドがあるかどうかがわからないですよね。
原因としては
1.そもそもタンパクの量が少ない。
　濃縮後のタンパク濃度はいかほどでしょう？
　薄すぎるということはありませんか？
2.タンパクの変成作業は適切ですか？
　SDSの濃度や変成温度は足りていますか？足りていないと変成が中途半端でタンパクが（複合体を作って）くっついて大きくなり流れなくなったり、マイナスの電荷が足らなくて泳動できない可能性があります。
とりあえずその辺の確認をしてみてはいかがでしょうか？
すでにしていたらごめんなさい。

この回答へのお礼

濃縮度をあげたり、SDSの加熱処理時間の増加などいろいろ試してみたら改善されました。ありがとうございました。

お礼日時：2004/06/21 15:35