精製方法の違いが分かりません

シークエンスPCRを行う前の精製はカラムで実施していますが、シークエンスPCR後（シーケンサーに乗せる前）の精製はエタ沈です。

どちらもDNAを精製する方法なのに何が違うのでしょうか？教えてください。

No.2 ベストアンサー 回答者： Chicago243 回答日時： 2016/05/31 01:22

前者と後者で決定的な違いは容量です。

シーケンス反応はフォーマットによっても違うかもしれませんが、１５microLとか微量の容量でマシンにかけます。カラムも微量用であればそれぐらいで回収できるかもしれませんが、一般の精製用カラムはそれよりも容量が数倍多いです。カラムを使ってもいいかもしれませんが、後者の目的は未反応物を除くのが目的です。汚いDNAを精製するのに工夫されたカラムを使う必要もないでしょう。また、未反応物がカラムで除けるのかはその化学的性質によりますので、カラムでやるなら注意が必要です。

昔はシーケンス反応後ゲルろ過の簡易カラムで精製していることもありました。未反応物の分子の大きさが反応で出きた産物よりはるかに小さいのでサイズで分離できるゲルろ過カラムで精製が可能ですので。ただしクルードなサンプルから精製するときはゲルろ過ではあまり綺麗にはならないと思います。

No.1 回答者： larme001 回答日時： 2016/05/25 01:35

精製方法によって得られる純度とコンタミしてくるものが違ってくるでしょうね。

この場合シーケンス反応に残存ポリメレースとかRNA、プライマー、dNTP(PCR産物ならば）などが入ってると結果に大きく影響が出る可能性が高いので綺麗にした方がうまくいくからでしょう。
シーケンスPCR(厳密にはPCRではありません）は、精製というよりも濃縮にちかいのではないかな～ともいます。でも、一番はコストと労力（時間）の兼ね合いです。

とは言っても、実際はシーケンス前のテンプレートはゲル片を遠心かけて上澄み液から無理やりやることもあれば、シーケンス後の精製はマグネットビーズとか専用の精製キットをケチって使う場合もありますよ。エタ沈だと汚くなることが多いのは事実ですし。