分子生物学の実験が行き詰まりました。

タイトルの通りです。手順は以下のとおりです。
一、ホストベクターをXbaIで切断。PCI抽出とエタ沈で精製。
二、導入したいインサートの形が「NheI切断末端ー(導入したい塩基配列)ーXbaI認識配列ーApaI切断末端」となっているので、先に片方だけをライゲーションして、泳動。切り出し精製する。
⇨NheI,XbaIの切断部位は相補配列となるから結合する。
三、全体として「(ホストベクター)ー(導入したい塩基配列)ーXbaI認識配列ーApaI切断末端」となっているので、今度はXbaIで切断を行い、電気泳動。ゲル精製。
四、ライゲーションして環状化。
以上が作成の流れなのですが、これを大腸菌に導入して、生成したコロニーのPCRを行うと、セルフライゲーションらしきバンドが得られます。

自分の考えとしては、二、の時のライゲーション産物の泳動を確認して見ると、環状化されたプラスミドは確認できておらず、目的の長さのバンド(5385bp)と、わずかに10kbp付近にバンド得られたので、ホストベクターとインサートはうまくライゲーションが出来たのではないかと考えましたが、それではセルフライゲーションが起きる原因が思い浮かびません。
かれこれこの作業は1ヶ月近く続いており、いまだ目的産物が見つからない状態です。どなたかアドバイスをお願いします！どなたか助けてー。

No.1 回答者： otx 回答日時： 2012/08/29 13:44

ライゲーションは何が原因か？と言われると、

見てもいない者からでは、なかなか指摘が難しいです。

可能性を言い出したら、ある意味キリがありません。

私の経験から（個人的な好みも含む）言わせてもらうと、

２のステップは、やりたいことはわかるのですが、
ライゲーションで思った通りの産物は。泳動で確認できる程
出来ていないと思うのですが・・・。

つまり、２で見ているバンドはそもそも目的産物ではないのではないかと。

ライゲーション産物はそもそも、少なく出来上がるような条件で
行なうので（Ligaseのプロトコールにも、そんなに多量のDNAを使うようになっていないと思いますが・・・）、
泳動してバンドで見える程、ライゲーション産物が出来上がるくらい多量のDNAを用いては
ライゲーション自体があまりうまくいかないような気がします。

私のお勧めとしては、
ライゲーションは単純な実験系で行なう方が、結果的にうまくいくということです。

なので、

XbaIで切ったベクター
と
NheIー(導入したい塩基配列)ーXbaI
となるように、すでに切った目的産物

これらを１ステップでライゲーションしたらどうでしょうか？

そして、PCRでインサートが確認できたものから、目的産物のベクターに入った「方向」を
制限酵素マップなどで確認して、自分が求める方向に入ったクローンを選ぶ

この方が、結局いいと思います。

この回答への補足

回答ありがとうございます。ライゲーションに関しては、1つのチューブのホストベクターDNA量を100ng程度におさえて計6チューブ作り、6レーンで泳動して切り出してます。

補足日時：2012/08/29 17:29

No.2 回答者： hiddenleaf 回答日時： 2012/08/29 15:25

なかなか複雑な方法を行っていますね。

恐らく様々な事情があるのだと思いますが、No１様が述べている通り
ライゲーション操作はシンプルな方が良いです。
別の方法、例えば
・ベクターMCSを他のベクターと入れ替えてやる
・PCRでインサートにやりやすい制限酵素サイトをくっつける
・インサート両端をXbaIでカット後ライゲーションで正方向に入ったものを探し出す
等々。
そんなことはもうやったよということでしたらすみません。

この回答への補足

インサート両端をXbaIでカット後ライゲーションで正方向に入ったものを探し出す
についてなのですが、それはPCRを行って方向を確認する！みたいな方法でしょうか？
申し遅れましたが、私が作成しようとしているのは同一塩基配列のタンデムリピートベクターなので、インサート内の配列からプライマーを設計すると、リピート数が増えるごとに、プライマーの結合特異的部位が増えてしまうので、うまく増幅されなくなるおそれがあるので、やむなく複雑な方法になってしまいました…

補足日時：2012/08/29 17:42

No.3 回答者： otx 回答日時： 2012/08/29 18:06

>1つのチューブのホストベクターDNA量を100ng程度におさえて計6チューブ作り、6レーンで泳動して切り出してます。

結局、1レーンに100ngのベクターになるのでしょうか？
もし、間違っていて、６チューブをまとめて１レーンで泳動して、としても

私の経験上、ライゲーション産物が泳動で確認できるほど、多量の産物はできないと思います。

経験上、泳動で確認できるようであれば、大腸菌に導入してしなくてもいい実験もあり得るかと思いますが、
（例えば、インサートを別のベクターに入れ替えるだけの場合とか）
泳動で確認して切り出しをやって済ませている人を私は見たことがありません。

大腸菌に導入してクローンを得る過程には、
少ないライゲーション産物をenhanceして拾うことができる
ということも含まれると思っています。個人的に、個人的に、個人的にです。

理論上は、質問者さんの方法に問題はありませんが、私の経験上こう思います。

あと、インサートのチェックの仕方には、色々あります。
究極はシーケンスをすることですが、制限酵素を使ってもインサートによっては可能です。

思った通りにできているプラスミドは、この制限酵素では切れるがこれでは切れないとか。
この制限酵素で～bpのバンドが出るのが目的のものだとか。

この辺は、質問者さんの周りにいる先達に直に習った方がいいと思います。
実際に見る教えてもらうことよりも有効な学習はありません。

頑張って下さい。

No.4 ベストアンサー 回答者： browntraut 回答日時： 2012/08/30 17:11

ベクター：XbaIカット

インサート：NheIとXbaIのダブルダイジェスションでカット

で、そのままライゲーション。

NheIとXbaIは結合

XbaIとXbaIも結合するため、リバースに入る可能性が50%。

インサートの丁度真ん中で切れないような（偏って切れるような）シングルカッターを見つけ、

その酵素がベクターにとっても１～２か所切れれば良いが、切れなければ、
インサートにはノーカッターだけれども、ベクターにはシングルカッターの酵素とともに
ダブルダイジェスション。

バンドパターンを見て、順入りか逆入りを区別する。

多分これでイケます。

ところで、XbaIはメチル化の影響を受けますが、切るべきDNAはメチル化してませんか？
配列は大丈夫ですか？

この回答へのお礼

PCR産物を制限酵素切断する事で判断するわけですね。ありがとうございますo(^▽^)o

お礼日時：2012/09/06 08:55

No.5 回答者： hiddenleaf 回答日時： 2012/08/31 08:51

補足ありがとうございます。

PCRはベクターとインサートで挟んで行うわけです。
タンデムリピートであっても、PCRが掛かるか掛からないかで判断。
つまり得られるバンドの長さではなく、バンドが出るか出ないかで判断すれば良いのではないでしょか。
正に入ったものはゴチャっとバンドが出て汚いかもしれませんが・・。
少なくとも負に入ったものはPCRが掛からないハズ。
そんな感じで設計出来ませんか？
配列分からないので、的外れな答えだったらすみません。

この回答へのお礼

なるほど。ご教授ありがとうございますo(^▽^)o

お礼日時：2012/09/06 08:52