タンパク質の発現について…。

久しぶりに質問させていただきます。融合GFPを取り扱う実験を行っているのですが、融合GFPがコードされたプラスミドDNA(Aとします。)から融合GFP部位の塩基配列を他のプラスミドDNA(Bとします。)に組み込む実験を行っています。PCRによって、ベクターBに融合GFP部位の塩基配列の導入が確認出来たのですが、いざこのプラスミドDNAからタンパク質を発現させ、抽出すると、GFP発光が全く確認出来ませんでした。
ホストベクターの種類によって、発現が抑制されるような事ってありますか？また、ライゲーションのやり方によって、3文字の認識コドンがずれる事とかあるのでしょうか？
ちなみに、このクローニングでは、タカラバイオ様のIn_fusion酵素を用いています。
よろしくお願いします。

No.3 ベストアンサー 回答者： browntraut 回答日時： 2012/11/10 08:16

No2です。

そうですか、ベクターAの時点でコンストラクトは完成したという訳ですね。
pcDNAにサブクローニング後、細胞での発現が・・・という問題ですね。
ベクターAで発現は確認されているので、きちんとライゲーション（In fusion）されていれば発現すると思いますが、
下記事項をご確認されてみては？

１）遺伝子導入はPCRではなくて、遺伝子特異的な制限酵素切断をするかどうかを調べる。
→　PCRのインサートはPCRのプライマーで増幅することは確定しています。内部の配列がどうであれ。
きちんとした遺伝子が挿入されたかは、目的の遺伝子にユニーク（シングルカッター、ダブルカッター）の制限酵素をもちいることで信ぴょう性良く確認できます。

２）遺伝子発現するためには、細胞へのトランスフェクションが必須かと思いますが、それは問題ありませんか？
目的の細胞に効率のよいトランスフェクション法ですか？
ポジコンとしてpcDNAGFPオンリーなどを使えば、トランスフェクションがワークしているかをチェックできます。
大腸菌に比べてマンマルは蛋白の発現量が少ないですので、より感度が良い方法で判定した方が良いかもしれません。
つまり、抽出の前に細胞を蛍光顕微鏡で覗いてみる。
発光があれば良いですが、ないのであれば細胞を潰してウェスタン（抗GFPで）してみる（ポジコン同様）。
バンドが出れば発現はしているけど、発光していないだけ（構造的問題）と言えるでしょう。

この回答へのお礼

色々と自分で考えてみた結果、遺伝子導入を行った大腸菌に問題があるのではないかという結論に至りました。ベクターＡを作製した際には、BL21(DE3)というT7RNAポリを発現させる大腸菌株を用いていたのですが、ベクターBを作製した時には、BL21(DE3)ではなく、クローニング用の大腸菌株を用いていました。なので、さっそくベクターBをBL21(DE3)に形質転換を行い、発現タンパク質が光るかどうかの確認を行ってみます。それでもうまくいかなかったら、browntrautさんがおっしゃった方法を試してみたいと思います。
色々とアドバイスをいただき、ありがとうございます。

お礼日時：2012/11/10 10:25

No.2 回答者： browntraut 回答日時： 2012/11/09 19:02

もう少し詳細（ベクターの種類、発現ホスト、発現チェック法、なぜAからBにサブクローニングするのか？）などをお知らせ頂けるとアドバイスしやすいのですが。

それなしで考えましょう。GFPをどのような遺伝子と融合したかはどうでも良い問題です。

１）目的の遺伝子がクローニングされているのか不明です。
例えば、プラスミドAから目的の遺伝子だけをB（GFP融合用ベクターなど）へサブクローニングし、融合タンパクを作ろうとしているのでしょうか？
はい→　GFP fusion用プラスミドはN末用、C末用などが準備されており、MCSがあるので適合した制限酵素で切り貼りができますが、In fusionで適当にチェンジしてしまうとシフトの危険がありますね。In fusion自体がいけない訳じゃなく、In fusionするためのインサートの配列と受け入れ側の配列がしっかり合っているか確認が必要です。また、C末GFPタグベクターなのに、インタクトな遺伝子（ストップ付き）をご丁寧に融合してやると、もちろんGFPは発現しません。その逆でN末GFPタグベクターの場合はGFPのフレームに細心の注意を払うことが必要です。フレームがズレて発現タンパクが不完全になります。最悪は細胞内で分解されてしまいます。

２）目的の遺伝子がすでに融合されている場合（いいえの場合）
すでに作製済みの融合タンパク質の遺伝子をサブクローニングする場合は、プラスミドAの時点で発現は見てみましたか？最適なホストでAが発現していないなら、Bでも発現しないと思います。しかし恐らく、A→Bのサブクローニングは目的のホスト細胞での発現チェックを実施したいがためにやっているものだと推測していますので、下の質問の項目に移りますね。

質問
・ホストベクターの種類によって、発現が抑制されるような事ってありますか？
あります。pBluescriptなどは大腸菌用、pcDNAなどはマンマル用です。アベコベで使うと発現しません。また、tetオペレーターのベクターは単独では発現しない場合があります。遺伝子の発現はプロモータに依存するので、使いたいホストにマッチしたプロモータをプラスミドが持っているかどうか確認してください。それから、ユビキタスプロモータ以外のプロモータを用いると、遺伝子発現は細胞依存的になります。目的の細胞でしか発現しなくなります。
ライゲーションですが、スタートからストップまでの遺伝子ができあがっており、それをそのままライゲーションするのであればフレームシフトの心配はありません。しかし、融合タンパク作製時に制限酵素が合っているからといって、適当にライゲーションをするとズレますので注意を。

この回答への補足

長文の回答ありがとうございます。詳しい事を申しますと、自分が作った融合タンパク質は、2つに分割したGFPをペプチドで繋いだものです。最初はPHATベクターに融合タンパク質をコードした塩基配列を導入し、大腸菌に形質転換を行いました。これからタンパク質を発現させ、抽出した時には発光が確認出来ました。
次の段階で、今度は細胞で観察を行うために、今度はpcDNAに融合タンパク質をコードした塩基配列を導入し(in_fusion酵素)、大腸菌に形質転換を行いました。しかし、これからタンパク質を発現させ、抽出したものからは発光が確認出来ませんでした。ちなみに、プラスミド抽出を行い、導入確認のためのPCR産物からは目的バンドが得られました。
フレームシフトに関してはノータッチでしたので、調べてみます。

補足日時：2012/11/09 21:06

No.1 回答者： hiddenleaf 回答日時： 2012/11/09 14:54

融合タンパクであるのならば、発現が抑制されることはあまり無いと思いますが。

注意して実験計画を立てないと、コドンは普通にズレます。
きちんとシークエンスとにらめっこして、プロトコルを作らないとえらい目に会いますよ。
普通この手の実験はシークエンスまで行うのですが、どうでしょうか。
配列を確認しなければ、何が原因か分からないままですよ。
確認してみましょう。
コドンずれも無く正しい配列なら、今度はウェスタンでもしてみましょう。
融合タンパクとしてきちんと分子量が増加しているか確認しましょう。
配列OK、発現OKでも光らないというのなら、これはもう相性の問題です。
根本的なところから、N末に付けるのかC末に付けるのか、他の蛍光タンパクにするのか。
色々考える必要がありますね。

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。自分が勉強不足だったみたいなので、色々と調べてみます。

お礼日時：2012/11/09 23:01