DNA配列決定とPCRの関係

未知の配列を調べる（決定する）ために
抽出したDNAの量が少ない場合は
PCRが必要ですが、

未知の配列なのでprimer配列も決めることが出来ず、
primer配列を決めることができぬならば
増幅したDNAを使った配列決定も出来ぬという話になります。
結局、PCRが不必要なほどのDNA量が抽出で得られぬならば
未知の配列を調べることもできぬ。

この理解には根本的な誤解が有りますか。
DNAをいじったことが無いので易しい解説をお願いします。

No.4 回答者： negigi 回答日時： 2014/02/18 00:10

うーん、使ったことが無いので何とも……。

私が試料を送る場合は何らかの方法でpurifyしてるので、そこも委託するとなるとチョット分からないです。あまり安すぎると、信頼性という点で不安がありますが、利用経験があるのならそこを使うのが良いのでは？

というか、情報が小出しされて、結局何がされたいのか分からないのですが、ある植物の全ゲノムから任意の1500 bp程度の配列を読みたいってことなんでしょうか？

この回答へのお礼

＞何がされたいのか分からない

下のお礼に書きましたよ。
同/異種で有ることを言う目的です。
barcoding用の短い配列での種間比較で。

その領域のは業者が提供する汎用primerには無いので
合成してもらわねばならず、
文献情報を寄越せといわれました。
しかし、文献のとは別種が対象種なのでprimer自身に
配列違いが有るかもしれませんから
文献と同じprimerでやって
失敗したら費用が損するなあと心配で。

お礼日時：2014/02/20 20:33

No.3 回答者： negigi 回答日時： 2014/02/17 14:54

間違えた。

nmolではなく、ngオーダーです。
私がsequencingを外注してるところですと、1500 bpなら、20-80 ngで用意するように求められています。1 runでだいたい1000円くらいですね。

次世代sequencingは外注したことがないですが、1 sampleで数万～数十万といったところでしょうか。読む量が全然違いますから、単純比較はできませんが

この回答へのお礼

料金が出たのでついでに。
最安値の受託分析会社または機関は
Macrogen Inc. (Seoul, Korea)で、次が秋田大学ですか。

植物試料を渡しての全段階完全委託での
現在の最新安値情報が上記とは違ってきておれば教えてください。

前に料金を尋ねたら農大構内にも有るMacrogen施設では
植物試料を渡しての抽出以降からだと
韓国に送らねばならぬとの返事でしたが他が今もそうですかね。

訳本が出ているほどに、USでは押入れバイテクがはやりだそうなので
私も自宅で趣味として
生物集団比較で種の異同を言うだけの水準の報告なら
委託で楽ちんなroutine+enumeration報告を書けるなあと
目論んでおります（＾\＾）

お礼日時：2014/02/17 15:47

No.2 回答者： negigi 回答日時： 2014/02/17 13:27

なんだ。

そんなに短いんですか。だったら、第1世代の方がいいですね。いわゆる一般的なsequencingはこっちです。
1500 bpがまるまる未知配列なら、適当なベクターに導入して、ベクター上に設計したprimerで配列を読みますね。量は少なくても、大腸菌で増やしますから問題ありません。
1500 bp内に既知配列があるなら、そこにprimerを設計して読むこともあります。

量が少ないというのが、具体性がなくて分からないのですが、読むだけならnmolのオーダーで十分ですよ

外部委託なら第2世代の方が高いですが、そもそも目的が違うので、比較する意味もないです。

No.1 回答者： negigi 回答日時： 2014/02/17 03:19

primer配列を設定する必要があるのは、ダイターミネーター法などの第1世代シーケンシングの話です。

いわゆる第2世代シーケンサーというものは、未知DNA配列をドカッと大量に読むものであり、配列内部にはprimerを必要としません。いくつか方法はありますが、代表的なものとしてブリッジPCR法があります。具体的に言うと、数百塩基長のDNAにアダプター配列をくっつけまして、このアダプターの相補的なDNA断片をprimerにして増幅する方法です。こうして得られた断片を一気に読み取り、得られた大量のデータから配列を解析します。
http://infobio.co.jp/?portfolio=%E6%AC%A1%E4%B8% …

近年はさらに第3世代シーケンサーがすでに市販されており、これらは脱蛍光だったり一分子レベルの読み取りが可能になってたりします。

この回答への補足

おっと根源的な条件を付け忘れ:
粗抽出したDNAの量が少ない場合デス。

補足日時：2014/02/17 09:33

この回答へのお礼

早速の御教示に感謝します。
さらに疑問が生まれました。

第2世代シーケンサーは未知DNA配列を大量に読むとのことですが、
Q１）1500 bpsが対象では短いので
使いませんか。

Q２）配列決定を外部委託に出した場合は
装置の世代が違うと料金が違いますか。
ついでなのでこれもお願いします。

お礼日時：2014/02/17 09:28