細菌の未知のmRNAの配列を特定する方法

組み換えDNA実験初心者です。
細菌の蛋白質の発現量をmRNAで追いかけようとしています。
蛋白質のアミノ酸配列解析などを介さずに、未知のmRNAの配列を特定する方法は無いでしょうか？

No.5 回答者： myahmyah 回答日時： 2004/07/16 22:03

全く新しい蛋白質について調べたいのですか？

他の生物で配列のわかっているものであれば、相同性の高い部分をプライマーにRT-PCRを用いるのが一般的かと思います。
もし、全く新しい蛋白質ならばやっぱりアミノ酸配列を読んでからになりますでしょうか・・・。
蛋白質から遺伝子配列を推定するには、アミノ酸配列の解析をせずにとなると、私はわかりませんね。
ごめんなさい。
アミノ酸配列の解析もやってみては？おもしろいかもしれませんよ。

この回答へのお礼

皆さんご回答ありがとうございました。
やはりこっちからのアプローチは難しいのだと思います。
も少し試行錯誤してみますので、また相談にのってやって下さいませ。

お礼日時：2004/07/21 11:54

No.4 回答者： radicalase 回答日時： 2004/07/16 20:32

No.2です。

や、すみません・・・原核生物でしたね。
確かにおっしゃるとおり、スプライシングの過程はありませんね。

そうなると、恐らく両方の末端に遺伝子特異的な配列があり、それからプライマーを設計しているのでは？
未知の配列といっても、一般的な配列の相同性はあるはずです。

この回答への補足

そこなんですよ。未知の蛋白一つであれば何とかなりそうかなとは思ったのですが、No.３さんで補足させていただいたように、単一のものがターゲットで無い場合はやはり難しいのでしょうか。

補足日時：2004/07/16 22:02

No.3 回答者： fcmie 回答日時： 2004/07/16 12:14

　目的タンパク質の種類が判っているなら、まず他の種の同じタンパク質の配列を調べます。

目的の細菌のゲノムが公開されているなら、多種のものと比べて、目的遺伝子の配列が分かるでしょう。
　ゲノムが公開されてなければ、他の種でよく保存されているアミノ酸配列を元に設計したデジェネレートプライマーを用いて、cDNAからPCR増幅できるか調べます。増幅された目的遺伝子配列をシークエンス分析します。
　判明した部分配列を元にプローブを調整し、ノーザンブロットとか、RT-PCRとかします。でも、他にもっといい方法があるかもしれません。

この回答への補足

ご回答ありがとうございます。
蛋白の種類は分かっているのですが、単一ではない個体群が発現している複数の蛋白質の中で、一番多く発現しているものをmRNAの発現量で追うことは出来ないのかなと思ったもので。
ですから、プロテアーゼやアミラーゼなど、主要なものはある程度予想できるのですがそれらを含めて全てを一度に効率良くなんて言うと、そんな方法はないんでしょうか。

補足日時：2004/07/16 21:59

No.2 回答者： radicalase 回答日時： 2004/07/16 01:02

まず、目的のmRNAを含む画分をショ糖密度勾配遠心で分離して、mRNAを取り出します。

mRNAは前駆体RNAからのスプライシングの過程で３´末端にポリＡが付加されます。ここで、ポリＴとして逆転写酵素によるcDNA合成をします。


このcDNAについてシークエンシングを行えば、cDNAの配列が決定できるので、これよりmRNAの配列もわかります。


ということだと思いますが、cDNAのシークエンシングに用いるプライマーは何を使うのでしょうね。そこはわかりません。

この回答への補足

ご回答ありがとうございます。
私は原核生物はmRNAにポリAが存在しないものだと認識していましたが、ポリTで逆転写可能なのでしたか。
その場合、cDNAのシークエンシングに用いるプライマーはポリTで可能ではないのでしょうか？mRNAは未知の配列なのでプライマーは設計できないです。

補足日時：2004/07/16 09:19

No.1 回答者： myahmyah 回答日時： 2004/07/15 23:04

逆転写反応を使う方法が一般的ではないでしょうか？

RNAからDNAを合成することが出来る酵素を用いて、
RNAからDNAを合成し、DNA seaquencerで解析できると思います。
発現量についてはnorthern blotting を用いる方法が、定量性についても信頼されており、簡易的ですのいいのではないかと思います。
データとしてはタンパク量も添えることで客観性が増すかと思います。

この回答への補足

ご回答ありがとうございます。
Primerの必要が無い逆転写酵素があるということでしょうか？
mRNAが未知の配列なのでPrimerやProbeが作成出来ないので、良い手段があればありがたいのですが。

補足日時：2004/07/16 09:15