分光光度計での測定手順

Question

分光光度計である溶液の濃度を測定しています。
人によって二つのやり方があることが分かり、どちらが正しいかを検討しています。
ちなみにダブルビームです。
（方法１）
・キュベットＡとＢに水を入れてゼロ補正
・次にキュベットＡにブランク、キュベットＢにサンプルを入れて吸光度の差を測定する。
（方法２）
・キュベットＡに水、キュベットＢにブランクを入れてゼロ補正
・次にキュベットＡに水、キュベットＢにサンプルを入れて測定。
・ブランクとサンプルのそれぞれの吸光度の差を計算する。

どちらでも良いという人と、差があるようだという人と分かれています。どなたか教えてください。

paddler · Accepted Answer

以前、分光光度計の設計をやっていました（早い話、作る方のプロでした）。

操作上のミスや誤差を抜きにして言えば、装置的には優位な誤差に違いは
ないように思いますが、分光光度計の設計者が想定している使用方法は、
きっと（方法１）ですね（ひょっとして私だけだったらごめんなさい）。

関係しそうなポイントをいくつか挙げておきます。

１．ゼロ補正は、再現可能性の高いものを基準として実施した方が良い。
　　つまり、今日も明日も明後日も、特別なアクセサリを使用せず、
　　いつものキュベットで普通の水溶液で吸光度測定をする限り（有機溶媒
　　系で測定とかでなく）、試料Ａを測定するにも試料Ｂを測定するにも、
　　いつも０Absの基準は同じものにするのが望ましいです。そのためには、
　　"常に同じ"蒸留水同士で取るのがベターと考えます。

２．ダブルビームの分光光度計は基本的に、サンプル溶液とブランク溶液
　　の比をリアルタイムで測定することを前提に設計しています。
　　（きっとどのメーカーも）

ただし、これは作る側の立場で考えていることなので、使う側の方が
「こちらの方が理屈でも経験上でも良い結果が出る」ということであれば、
決してそれを否定するものではありません。
特に、分光光度計の設計者の多くは物理屋であり、使う方々の多くはきっと
化学屋さんである点は要注意かも知れません。

kgu-2 · Answer

分光光度計で測定する目的は、吸光度そのものではなく、検量線から、濃度を求めるのが目的でしょう。検量線には、必ず誤差があり、その方の誤差が大きいので、測定手順や方法をいくらきちんとしても、無駄が多いと感じまず。もっとも、分析の専門家を目指しているねというのなら別の話ですが。

　一番良いのは、化合物のモル吸光係数は、不動の値なので、適当な化合物のモル吸光係数を、現在思案されている方法で確かめられては。

　私の場合は、A、Bにコントロール(ブランクとすると、空っぽのものと間違いそうなので)の溶液をいれ、0補正をします。これで、セル誤差および光路の補正ができている、と考えています。
　次に、Bにサンプルを濃度の低い方から入れて検量線を描いています。これが教科書的な方法でしょう。

　シングルビームは、光路は1本ですから、光路の安定性の問題は可能性として残りますが、誤差はでません。
　ダブルビームは、光路の誤差は、補正されるような回路あるいは方法が、自動的に設定されているように想います。さもないと、使い物になりません。

　残るのは、セル誤差ですが、同じ溶液を入れて、ゼロあわせをします。このとき、蒸留水ではなく(可視部を測定するなら、吸光度が0.02ほどあれば『色がついている』と感じるので、蒸留水でもOKかも)、反応のための試薬などが入ったコントロールを使っています。

kgu-2 · Answer

ダブルビームの補正目的は、1)回路の光の量、2)セル誤差でしょう。

1)光の量は、Aにブランクを入れ、Bに標準液及びサンプルを入れれば、補正が不要では。
2)のセル誤差は、セルにブランクなり、蒸留水なり、同一のものを入れればOKでしょう。

　その操作で、何を補正したいのか、を明確にされては。私は、方法1です。
　最近の機械は、優秀なので、機械自体の誤差は考えていません。セル誤差は、学生時代に経験しています。それでも、0.02程度でしょう。
　ただ、プラスチックセルについては、知りません。1mlのセルも誤差が大きかった記憶があり、使いません。したがって、サンプル量は4ml以上にしています。

Bubuca · Answer

こんにちは

doc_sundayさんの手順はすごいですね。わたしはそこまでやりません　(^_^;
１、３で補正してあとは５です。
もちろんセル（キュベット）は必ず同じ物を同じ向きで同じ場所に入れます。
室温が変わったりして怪しい感じがしたら補正はやりなおします。

分光光度計にもよると思いますが、（方法２）よりも（方法１）の方が手間が少ないように思います。
揮発して濃度が変わったり、時間が経つと酸化されたり変色するようなブランクでしたら（方法２）しかないですね。

doc_sunday · Answer

>どちらでも良いという人と、差があるようだという人と分かれています。
分かれると思います。
ですが私はもっと複雑なことをします。
１.ＡとＢに水を入れ測定する。
２.ＡとＢを交換して測定する。
３.Ａに水Ｂにブランクを入れて測定する。
(なおこのときＡ側が測定時「ブランク」となる光路である。
４.Ａに水Ｂにサンプルを入れて測定する。
５.ＡにブランクＢにサンプルを入れて測定する。
これだけ全部やらないと気が済みません。
ブランクがきれいか(不純物がないか)、キュベットが汚れていないか、光路のバランスはとれているか。
全部調べます。
時にはＡＢ両方にブランクを入れて測定することもあります。
でも、１回やったらあとは４か５だけを異なるサンプルに対して行います。
くどい人は終わったあとで(時には途中でも何回か)ブランクや水での補正を繰り返すようです。
m(_ _)m

分光光度計での測定手順

以前、分光光度計の設計をやっていました（早い話、作る方のプロでした）。

分光光度計で測定する目的は、吸光度そのものではなく、検量線から、濃度を求めるのが目的でしょう。

ダブルビームの補正目的は、1)回路の光の量、2)セル誤差でしょう。

こんにちは

>どちらでも良いという人と、差があるようだという人と分かれています。

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