酵素について

野菜に含まれるアミラーゼの活性について実験しています。
野菜の上澄みを塩析して透析後、デンプンと反応させ、薄層クロマトグラフィーで活性を調べるとマルトースまで分解されました。
しかし、同じように上澄みを塩析、透析後、電気泳動を行い酵素を分画してからデンプンと反応させ、クロマトグラフィーで活性を調べると何も出てきませんでした。
教授が言うには、その酵素はサブユニットを構成しているため分画すると活性が出ないのではという結論になったのですが、そのほかに何が原因と考えられますか？
わかりにくい文章で申し訳ないです。

No.8 回答者： kgu-2 回答日時： 2003/01/28 01:43

それでは、電気泳動しないもの(できたらタンパク量は、電気泳動にかけるものと当じ量)に、電気泳動したゲル(同じ量の固化したPAGEのゲルで十分)を加えて、乳ばちですりつぶし、TCA、エタノール処理をしても、活性はでてきますか。

要するに、電気泳動しないものを、電気泳動したものと同じ条件で測定しても、活性はでてきますか。
　
　これで、活性がでてくるのなら、電気泳動自体が活性を消失させる原因としか思い付きません。
　タンパクが変成したか、補酵素(必要なのかどうか知りませんが)が外れたか・・・・。

　あるいは、私が昔やっていた血液中のレチノールバインディングプロテイン(RBP)は、血液中ではプレアルブミンと結合していますが、disc電気泳動(当時は平板のものがなかった。原理は同じです)をかけると、SDSを添加していなくても、両者は分離します。こんな例もありますが、電気泳動をかけると、結合して安定化に役立っていたタンパクが分離した、というのは苦しすぎますね(RBPは、単独でも安定です)。

　いろいろな可能性を考えられることが、将来、お役に立つと信じています。状況が分からないまま書き込んでいますので、失礼な点はご容赦を。

No.7 回答者： kgu-2 回答日時： 2003/01/27 01:17

No6の訂正です。

discというのは、私の思い込みでした。

　平板のPAGEは、電気泳動にかけることが出来る量が100μl以下だと想うのですが、この量と同じ量で(塩析後のもの)、電気泳動にかけずに、活性がでてくるか(正確には、検出できるか)試して下さい。
　活性がでるのなら、同一量を電気泳動し、ゲル全体と反応させれば、電気によって失活しない限り、活性は検出できるはずです。ただ、酵素はゲル内に閉じ込められている状態ですので、基質と反応しにくいと思います。よく振るなどして、反応しやすくして下さい。

この回答へのお礼

ありがとうございます！
塩析後のものを電気泳動かける前に活性が出るかはやりました。それは活性でるんですよ。でも電気泳動をかけると出なくなるんです。
基質と反応しにくいですよね。なので乳鉢ですって粉々にしてバッファーとデンプン溶液を入れて37℃で40分以上反応させてます。そのあとTCAで反応をとめてエタノールで沈殿させて、その上澄みをクロマトです。

お礼日時：2003/01/27 09:54

No.6 回答者： kgu-2 回答日時： 2003/01/27 01:01

SDSを加えないPAGEでは、サブユニットにならないハズですが。

　通常のディスク電気泳動では、分子量は30万以下でないと、PAGEの穴より大きすぎて出発点に引っ掛かって流れないようです。普通のアミラーゼは6万くらいでしょえから、この点はOKでしよう。ただ、特殊なアミラーゼなら分かりませんし、教授がサブユニットと仰るからには、分子量が大きいことも少しの可能性はあります。
　次は、アミラーゼが補酵素として金属が必要なら、電気泳動中に外れたことも考えられます。
　単純には、電気をかけること自体で失活した可能性もゼロではありません。

　一番気になるのは、酵素量です。電気泳動にかけることのできるタンパク量は、ディスク電気泳動ということなので、少ないのではないのですか。電気泳動をしない場合と、タンパク量は同一量で反応させているのでしょうか。
　澱粉との反応時間を24時間とか、長時間やってみられてはどうでしょうか。

　discというのは、本当にdiscなのですか。学生時代に使っていたので、懐かしく感じました。というのも、今では平板のPAGEになっていると思っていたものですから。この実験なら、平板の方がやりやすいようにも感じるのですが。

　この種の実験は10年以上やっていないので、回答に自信ありません。教授のお考えに反するようですが、サブユニット、というのに引っ掛かったものですから。

No.5 回答者： fujishiro 回答日時： 2003/01/26 20:11

＞バンドが出るところはもちろん、ゲルを縦に切ったものも活性が出ないのではどこを切っても出ないんですよね。

タンパクのバンドは出るんですね？
精製過程のタンパク一つ一つを流してタンパクバンドを比べてみましたか？
それで段階ごとに濃くなっているのがちゃんと見えるとしたらサブユニットが壊れている可能性が高い（タンパクがあるのに活性がない）でしょうね。
もしも段階ごとに濃くなってるタンパクがなければ…下の回答者さんがおっしゃっているように等電点のため、流れていない可能清が高くなります。

タンパクの等電点はわかりませんか？

No.4 回答者： Grace-Wonder 回答日時： 2003/01/26 18:13

SDSを使わないNative-PAGEってことは、－のチャージを持っている蛋白質しか、電気泳動されませんから、その酵素の等電点次第では、ゲルの中に入っていかないことになります。

一度、等電点電気泳動した後、デンプンを含んだアガロースゲルを等電点電気泳動ゲルの上に乗せて３７度で加温、その後アガロースゲルをヨウ素デンプン反応にかけてバンドを確認することも出来ると思います。Zymogramとか、active stainingって言うんですが、いちど文献など調べて見てはいかがでしょう。

この回答へのお礼

ありがとうございます。
私の勉強不足でなかなか進みません。
私はもう卒業なので次受け継いでくれる人に託したいと思います。
参考にさせていただきます。

お礼日時：2003/01/26 20:22

No.3 回答者： Grace-Wonder 回答日時： 2003/01/26 15:54

この酵素の電気泳動バッファー中の安定性、熱安定性、ｐH安定性はどうだったのでしょうか？電気泳動中に熱がかかって失活した可能性はあり

ませんか？

この回答へのお礼

ありがとうございます。
電気泳動中は今回６０Ｖを最初から最後まで続けていたので熱は出ていません。安定していたと思います。
他の日でも最大でも１８０Ｖで、熱は出ません。
pHの制限は泳動槽用のバッファーには特にありません。
途中で電圧をあげたりさげたりするのでも失活する可能性はあるのでしょうか？

お礼日時：2003/01/26 17:48

No.2 回答者： fujishiro 回答日時： 2003/01/26 11:38

分画後の酵素反応はどのように行っていますか？

酵素が分画されると思われるところを切り出しているのですか？

バンドがでるところはあっていますか？
当たり前ですがサブユニットがでるところにでても意味はありません。

Disk泳動をためしてみるのは？

この回答へのお礼

ありがとうございます。
酵素反応はでんぷんに４０分～１時間、３７度の恒温槽に入れて反応させています。酵素が分画されるところと、ゲル全体を縦に切って反応させています。それで両方とも活性が出ませんでした。
バンドが出るところはもちろん、ゲルを縦に切ったものも活性が出ないのではどこを切っても出ないんですよね。
Disk泳動をやるにしてももう時間がないので、今の結果をなんとか発表するしかないのです・・・

お礼日時：2003/01/26 17:44

No.1 回答者： mist-y 回答日時： 2003/01/26 02:35

電気泳動を行い酵素を分画っていうのが

どう言う風にやってるのか知らないんですけど。

電気泳動を行う処理で酵素が失活した。
または酵素が含まれていなかった。

ということが他に原因として考えられると思います。

この回答への補足

電気泳動の方法はＰＡＧＥ法でＳＤＳを使わないので酵素は失活しないはずなんです。
電気泳動を行う前の酵素は活性が認められ、電気泳動を流すと活性がなくなるんです。酵素は流せるだけ充分な量を流しており、タンパク質バンドは現れるんです。

補足日時：2003/01/26 02:39