DNAクローニングのメカニズムを教えてください！

バクテリアを大腸菌にクローニングするメカニズムを教えてください。遺伝子の組み込みはどんな方法原理で行っているのか、また、組み込みのベクターの選定は何に影響するのかなど、まったくの素人です。一言では、いえないとは思いますが・・・。

No.1 回答者： hebikera 回答日時： 2001/06/14 19:18

バクテリアを大腸菌にクローニング、というのはバクテリアの遺伝子を、ということでよろしいのでしょうか？でしたら簡単な説明を。

まず、バクテリアから取り出したDNAをPCRで増幅し、そのPCR産物を精製してベクターとなるプラスミド(あらかじめ制限酵素で切ってある)とリガーゼ(ライゲース)を用いて結合させます。一部のキットではこの際にライゲースではなく、特殊な加工をしたプラスミドを用いてイソメラーゼで結合させるようです。こうして組替えたプラスミドと、細胞壁をなくした大腸菌(コンピテントセル)を混合して氷中でしばらく接触させ、42度のお湯に2分間つけて(ヒートショック)、細胞内にとりこませます。この仕組みははっきりとは分かっていないのですが、ヒートショックにより細胞膜に隙間ができるとか、イマイチ説得力に欠ける説明があります(笑）。この形質転換体を培養することにより目的の遺伝子を持った大腸菌のコロニーを得ることができます。
組み込みの際のベクターの選定は、目的の遺伝子を再び取り出す際に使える制限酵素の種類や、形質転換効率、形質転換体かどうかをスクリーニングする際の手間(ブルーホワイトセレクションが行えるかどうか)などににかかわってきます。
おっと、そうそう、以上はベクターにプラスミドを用いた際の話です。
ベクターにλファージを用いる方法もありますが、かなり長くなりますし、組み込まれた大腸菌が死んでしまうのでご質問からは少しそれてしまうかもしれないため、一応割愛しました。
ご希望でしたらそちらも説明しますが？

この回答への補足

説明の難しい質問に、丁寧に答えていただきありがとうございます。確かに本筋とは離れるのですが、とても興味がでました。教えていただけますか？

補足日時：2001/06/15 00:28

No.2 ベストアンサー 回答者： hebikera 回答日時： 2001/06/18 11:23

それではご要望にお答えしてファージ編を。

まず、ファージとはバクテリオファージ、つまり大腸菌に感染するウイルスです。
ファージは大腸菌の体内に入ると大腸菌に自分の複製をたくさん作らせ、十分な量の複製ができると大腸菌を溶かして外に出ます。
実際の手順としては先ほどのプラスミドの際と同様に導入したい遺伝子を含むDNAとファージのDNAをライゲースで結合します。このDNAを特殊なタンパク質(ファージの外殻)で包み(パッケージング)、ファージを作ります。宿主となる大腸菌とこのファージ、そして寒天培地を混合して培養すると、培地が増殖した大腸菌でにごるのですが、その中に小さく丸く透き通った部分ができます。これはファージに感染した大腸菌が死んでしまうためで、この部分をプラークといいます。このプラークの部分には単一のファージが多く含まれているのでこれを精製し、液体培養などで更に多くの量を集めてからファージのDNAを回収し、制限酵素を用いて目的の遺伝子を取り出します。
しかし、用いる宿主によってはファージのDNAが大腸菌のDNAへ組み込まれてしまうため、大腸菌を殺さずに多くのクローンを得ることもできますし、また、λZAPというファージベクターを用いればヘルパーファージという別のファージの力を借りてλZAPの一部を普通のプラスミドにしてしまうこともできます。当然、プラスミドになってしまえば宿主も死にませんし、扱いも楽になります。その上、λZAPやλgt11などのベクターは導入した遺伝子をβ-ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現するため、遺伝子の機能解析や、抗体によるスクリーニングを行うこともできます。
以上がファージによる形質転換の大雑把な説明です。
また何かわからないことがあれば説明します。

この回答へのお礼

ありがとうございます！最近仕事が変わってまったく知らない遺伝子関係・・・。専門書は難しく、適当な本が見つからないまま泣いてました！上記の言葉も全部解る・・・とはいかないのですが、がんばります！またお願いします！

お礼日時：2001/06/18 23:00