ＰＣＲ法について

http://www.nurs.or.jp/~academy/igaku/a/a1123.htm

検索した所上記のＨＰがみつかりました、そこで疑問なのですが、標的の塩基配列は未知でよいとはどういうことでしょうか？授業では「増幅予定の塩基配列は既知でなくてはならない」と聞きました。それとプライマーが標的の塩基配列と完全と対合してなくてもよいとはどういた事でしょう？合わさって無くてもよいとは一体？

これは授業での事なのですが、１００ｋｂを超える断片に対してＰＣＲは実効不能であると聞きました。多すぎるとまた問題がおこるのでしょうか？

すみませんが、どなたかご解答を…ＴＴ

No.1 ベストアンサー 回答者： sunadna 回答日時： 2004/12/07 22:19

鋳型のDNAを何にするか（ゲノム・ｃDNAなど）にもよりますが、基本的には既知である必要があります。

特にプライマーの部分は既知でないと増幅できません。
しかし、プライマー間の部分は未知でも可能です。ただし、未知の場合は自分のほしいものを増やしたかどうかをシークエンサーで確認することになります。
ただ、特殊な例としてアミノ酸配列はわかっているがDNAを増幅したいという時、プライマー部分が未知でも可能にする方法があります。

100kbの話ですが、長くなると材料のdNTPが足らなくなったり、酵素が途中で増幅をやめてしまったりするのでかかりにくくなります。私はどんなに長くても2kb以内になるようにプライマーを設計しています。

この回答へのお礼

早速のお返事有難うございます、とてもよくわかりました。授業ではシークエンサーで確認することになる話は出てきてなかったので迷いました（後で調べるなり次週聞くなりしてみます）それで再び質問なのですが、専門的で私が分からない事かもしれませんが、「特殊な例」とはどのような状況なのでしょうか？

ＰＣＲチューブ入れるdNTPが足りなくなる可能性があるのですね、確かに長い…余分にはいってるとは思いますが。不可能というより、不測の事態（本当に不足）が起こることがあるかもしれない・との事なのでしょうね。

またまた疑問が出てきそうですが大変助かりました、また頑張ります。

お礼日時：2004/12/07 23:20

No.3 回答者： overthisgraysky 回答日時： 2004/12/08 13:13

「未知でよい」というのは、未知でも増幅可能であるということだと思います。

実際プライマー配列さえ標的遺伝子に対合すればＰＣＲ反応はおきますから。

＃１さんのおっしゃっている特殊な例について。
例えば、新しい蛋白質が発見されたとします。
この蛋白質の機能を研究するのに、遺伝学的手法（ＤＮＡ組み換え体の作製など）を取ろうとすれば、蛋白質をコードしている遺伝子が必要になります。
しかし、全く新しい蛋白質なので遺伝子配列が分かりません。
こういうときは、蛋白質の配列からmRNAの翻訳暗号をたどって遺伝子の一部の配列を予測し、予測された配列を元にプライマーを設計して目的の遺伝子（の断片）を増幅することが出来ます。
増幅された遺伝子断片を元にさらに周りの配列を増やすことも出来るでしょう。
特殊な例はこの他にもいくつか考えられると思います。

完全に合わさってなくてもいいのは、１つ２つくらいのミスマッチがあってもプライマーは鋳型に対合できるからです。
ミスマッチ入りのプライマーを使うことで、変異の入った遺伝子を増幅したり、制限酵素の認識配列が入った配列を作ったりすることができます。

この回答へのお礼

とても分かりやすいお返事をありがとうございます。ＰＣＲを使用する状況がまだはっきり分かってないので可笑しな質問をして大変申し訳ありません。皆様の有難いお返事を元に調べてみようと思います。

お礼日時：2004/12/08 18:24

No.2 回答者： ok_web 回答日時： 2004/12/08 00:33

No.1の方が答えられていらっしゃらない部分について補足します。

プライマーと、プライマーと結合する鋳型の領域は、その配列相同性が100％一致する必要は無いのです。
要は、プライマーが鋳型DNAにくっつきさえすればよいのです。
DNAはある一定以上の相同性さえあれば、お互いに結合することが出来ます。
この性質を利用した技術というのも存在します。
わざと100％相同性の無いプライマーを設計して、塩基配列を変えてDNAを増幅させることなどが出来ます。

PCRには様々な応用例がありますので、色々調べてみると面白いですよ。

この回答へのお礼

早速の返事有難うございました、そうなんですか100％一致する必要がないのは驚きでした！まだま知識が足りないので分からない事が多いのですがたくさん調べて勉強します＾＾

お礼日時：2004/12/08 18:22