No.2ベストアンサー
- 回答日時:
こんにちは。
半定量は行っておられるのでしょうか?一般的なPCRでは増幅曲線を描いた場合、
反応系のはじめのほうでは産物は指数関数的にどんどん増えていきます。が、やがて増幅がとまりそれ以上反応系を増やしてもこれ以上増幅がおこらないというプラトーに達します。
例えば25サイクル行った産物を電気泳動してバンドの太さを見た場合
そのサイクル数が増幅途中のサイクルか、プラトーに達してしまったサイクルなのかはこの試験自体(25サイクルの産物のみの泳動)ではわかりません。
プラトーに達してしまったサイクルのバンドの遺伝子量を測定しても必ずしも初期の遺伝子量を反映しているわけではないのです。
サイクルは20,22,・・・と取っており、プラトーでないことを確認しています。
ということは、自分のやっている方法で自身を持っていいのですよね!?
分かりやすく回答していただき、ありがとうございました。
No.3
- 回答日時:
ちゃんとコントロールをとれば定量性は高いです。
コントロールをとらずにバンドが濃いとか薄いとかで定量したり比較したりするのは説得力がありません。RNAの総量のコントロール(rRNAやhouse-keeping gene RNAなどの検出)
逆転写効率と絶対量のコントロール(合成した既知量のcompetitor RNAを加える。量を振って目的のPCR産物の量とcompetitor由来のPCR産物量が等しくなる点を検量線から求める)をとれば、real-time PCR以上の定量性があると言っても良いでしょう。
成書などから「competitive PCR」のやり方を勉強してみてください。
No.4
- 回答日時:
学生レベルでごく単純なことを。
つまりは、増幅率が理論値からずれることによります。nサイクルのPCRでは、理論的には2^nの増幅率になります。その理論通りに増幅されれば、定量性は問題がないでしょう。しかし、現実のサイクルにおいては、プライマーと鋳型の結合のステップがありますが、プライマーと鋳型の相対比が変われば当然、結合の効率が変わります。サイクルごとに理想的には鋳型2倍づつになるはずですが、プライマーが不十分であれば、2倍を下回ることになります。例えば、あるサンプルの増幅率が1.5倍であったと仮定すると、ほいと電卓をたたいたところ5サイクルで約、7.6倍でした。1.4倍だと約5.4倍の増幅率です。サンプルごとの増幅率を厳密にコントロールすることは困難ですので、増幅過程のない手法に比べて定量性は落ちることは否めません。primerの量も目的の遺伝子により振って検討していますので、充分に加えているはずです。
丁寧な回答をありがとうございます。
みなさん、どうもありがとうございました。
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
似たような質問が見つかりました
- その他(教育・科学・学問) 大学院生の授業ってこんなに適当なんですか 2 2023/05/17 13:36
- その他(教育・科学・学問) 大学理系研究室における器材の貸し出しや取り決めについて 1 2022/12/01 22:04
- その他(教育・科学・学問) 大学実験器材の貸し出しルール 1 2022/12/05 16:23
- その他(教育・科学・学問) (大学関係者へ) 大学の学生部屋の使用について 1 2022/08/17 22:38
- その他(教育・科学・学問) 大学教員へダメ出しをする別の教員 2 2023/06/07 19:28
- 飲み会・パーティー お酒が弱い人が飲酒をするのは高リスクという話は事実ですか? デマですか? 4 2022/08/20 13:24
- 大学・短大 続報 以前大学編入後に生じた問題から、こちらに質問 させていただいたものです。 詳しくご存知ない方に 1 2023/06/24 15:19
- 中途・キャリア さて、社会人になってから13年目。 今まで、機械設計、機械製品の品質管理、部門の経営企画をやってきま 4 2023/07/17 08:59
- 妊娠 出産経験のない女性は飲酒を全面禁止すべきではないでしょうか? 3 2022/04/12 17:27
- 教育・文化 高校生です。将来政治家になって犯罪率を0.0%代にしたいのですが、可能だと思いますか? ㅤ 大まかな 8 2022/08/27 18:51
おすすめ情報
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
-
PCRの失敗について
-
PCR組成とDNAのスメア
-
PCRで複数のバンドがでます。
-
末端複製問題について
-
PCRでDNAが増幅されないのは・・
-
エキストラバンドがでる理由
-
RT-PCRのランダム,オリゴdTプ...
-
oligo(dt)15 Primerの配列は、...
-
DNAを室温で放置してしまい、DN...
-
プラスミドへのインサート長が...
-
ゲノムDNAをテンプレートにして...
-
PCRの応用例
-
PCRでバンドが2,3本出てしまい...
-
シーケンスが上手くいきません...
-
DNAの塩基配列を決定するシーケ...
-
PCRの原理とDNA/RNAの生合成の...
-
サザンブロットのプローブを作...
-
PCRとシークエンス反応
-
転写反応には、どうしてプライ...
-
D-loopについて
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
-
PCRの失敗について
-
PCRで複数のバンドがでます。
-
PCRとシークエンス反応
-
転写反応には、どうしてプライ...
-
DNAを室温で放置してしまい、DN...
-
プライマーの劣化凍結融解について
-
PCRでバンドが2,3本出てしまい...
-
PCR組成とDNAのスメア
-
RT-PCRのランダム,オリゴdTプ...
-
エキストラバンドがでる理由
-
イノシン入りの縮重プライマー...
-
mRNA発現量を求める実験法
-
PCR プライマーの希釈
-
プライマーダイマーが出てしま...
-
定量PCRのスタンダード作製
-
rep-PCRって?
-
PCRのノンスペバンドの正体・・...
-
RT-PCRとリアルタイムPCRのプラ...
-
Long PCRのこつ
-
RAPDマーカーって何ですか?
おすすめ情報