大腸菌からのプラスミド抽出

現在工学部の大学院生です。
初めて生物的な研究をしますので、初歩的な質問ですみません。

大腸菌からプラスミドを取り出しているのですが、その前段階について質問します。
まず、プラスミドが導入されていないDH5αを、液体培養しております。
少量培養を8h、大量培養を16h行っております。
その際、アンピシリン溶液1mg/mlを、0.1ml(アンピシリン)/ml(培養液)となるように加えております。

そこで、質問させていただきます。
・プラスミドが導入されていないDH5αですが、大量培養後の大腸菌はプラスミドは入っていますか？
・培養時間は適切ですか？

先輩が言うには、アンピシリンを入れているので、プラスミドを持つ大腸菌以外は死滅するから、最初に導入しなくても良いと言います。
自分の疑問としては、プラスミドをもつ大腸菌が少なくなってしまうので、のちのプラスミド精製濃度が少なくなってしまうのではないかな、と思ってしまいます。

初歩的な質問ですが、よろしくお願いします。

No.3 回答者： w6o6n 回答日時： 2013/12/14 00:33

ご質問に対する回答は回答１で書いた通りです。

質問文では「プラスミドが導入されていないDH5α」とされていますが、
実際の実験は「最初にアンピシリン耐性遺伝子の載ったプラスミドをDH5αに導入し、
プラスミドが導入されている大腸菌と導入されていない大腸菌が混在したもの」ではありませんか？

もしそうでしたら、プラスミドを持つ大腸菌以外は増殖して来ないので
先輩が言われているようにプラスミドが入った大腸菌だけが増えてきます。
（ただしアンピシリンの場合は静菌＝殺菌には至らないので要注意）

そして質問者さんが懸念される通り、プラスミドを持たない大腸菌が混在すると
その分養分が減るのでプラスミドの収量が落ちる心配があります。

通常はプラスミドを持たないものや異常なクローンを排除するため、
一度プレーティングしてシングルコロニーにして、
正しいクローンであることを確認した後に大量培養します。

参考になれば幸いです^-^

No.2 回答者： w6o6n 回答日時： 2013/12/09 03:27

すみません。

こちらも補足をお願いします。

>アンピシリンを入れているので、プラスミドを持つ大腸菌以外は死滅するから、最初に導入しなくても良いと言います。

何を「最初に導入しなくても良い」のでしょうか？


質問文を拝見する限りでは、以下の様な実験に見えてしまいます。

「プラスミドを導入していない大腸菌をアンピシリン存在下で培養すると
いつの間にかアンピシリン耐性をもつプラスミドがどこからか入り、
そのプラスミドを回収することができる」

それは通常では考えにくい実験なのですが…

No.1 回答者： w6o6n 回答日時： 2013/12/09 03:16

ご質問にお答えします。

>・プラスミドが導入されていないDH5αですが、大量培養後の大腸菌はプラスミドは入っていますか？

ご質問の文章を見る限り、プラスミドを導入する工程がありませんので
プラスミドは入っていません。

>・培養時間は適切ですか？

前培養は対数増殖期の前半の状態であることが理想的ですので、概ね良いと思います。
大量培養の時間も一般的な時間だと思います。

「プラスミドが導入されていないDH5α」ではないか、
それとも途中でtransformationの過程はありませんか？
訂正がありましたら補足して下さい。