初めて質問いたします。
現在GST融合タンパク質を発現、精製するために、
pGEX6P-1(GEヘルスケア)というベクターを用いております。
培養条件は37度でOD0.5まで培養し、
IPTG 0.05mMまで添加後、
20度でovernight、培養しております(ホストはBL21でDE3ではないです)。
その後グルタチオンカラムで精製すると、
なぜか目的のタンパク質のほかにGSTそのものも発現しております。
他の目的タンパク質を導入した際にもこういったことがおきております。
こういったことは一般的なのでしょうか?
かなりGSTが発現してしまっているので、
カラムで精製したときに目的タンパク質の収率が非常に悪くなっているように思います。
アドバイスいただけますと助かります。
よろしくお願いいたします。
No.4
- 回答日時:
なるほど、目的タンパク質はインクルージョンボディでGSTは可溶性というのはよくある話ですね。
別にベクターのせいではないです。インクルージョンボディを溶解してリフォールドするか、目的タンパク質の全長が必要ないのであれば、どちらかの末端を削って可溶性画分にこないか試すといったところでしょうか。
また、わずかでも可溶性な全長タンパク質が取れているのであれば、リットル単位で培養ののち、目的タンパクとGSTを適当な方法で分離、精製という力業が意外と解決の近道だったりします。
この回答への補足
やっぱり一般的にあるんですか???
GSTそのものが発現(分解産物?)しちゃうケースって。
リフォールディングって個人的にあんまり信じてなくて。。。
やっぱり、ファーメンターで10L培養ですかね。
No.3
- 回答日時:
目的タンパク質のアミノ酸配列によっては、途中で翻訳が停止しやすかったり部分分解しやすかったりするので、そのせいかもしれません。
目的タンパク質も発現しているのならば、一度ゲルろ過などで目的タンパクとGSTを分離してしまうのも手です。
この回答への補足
そうですね。。。
その手は考えておりました。
ただインサートの異なるものでも、
同様な現象が起きているので、
ベクターの仕様なのかなぁとも思っているところです。
(シーケンスからコンストラクトは問題ないと思っているので。)
ゲルろ過、アフィニティ、消化、ゲルろ過(and, or)イオン交換がよさそうですよね。
インクルージョンボディも結構多くて、
収量があまり期待できないってのも難点です。
結構はまってますよね。。
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