アルブミンを使った検量線（Bradford法）

ウシ血清アルブミン（BSA）を使った検量線を作成しました。
BSAは0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mlの濃度に希釈し、
希釈したBSAを100μℓと（水 0.2ml＋Biorad 0.7ml）を900μℓ、
混合して595nmで吸光度を測定しました。
すると、実験の腕が悪かったのか線形近似では一つもプロットを通らず
切片もマイナスになったので、比較的キレイに書けた対数近似になってしまいました。

式は、y＝0.566X＋2.1988です。　（R2乗＝0.9621）

ここまではできた（？）のですが、
この式を使って、
自分のサンプルのタンパクの量（U/mg）が知りたいのですが、
どうやって出せばいいのかわかりません。

yにサンプルの吸光度を入れるのでしょうか？？？

No.4 ベストアンサー 回答者： guragura77 回答日時： 2008/01/22 20:07

BIO-RADのプロテインアッセイ（？）を使ってるにしては組成が変だし、そういうやり方でANo.3の方の言うような式が出るとは思えません。

試薬の使い方を確認してみてはどうでしょうか。
それから、ANo.1の方も書いておられますがXとYに吸光度とタンパク質濃度のどちらを当てはめたのかはあなたしかわかりません。XYのどちらが吸光度なのかはご自分で確かめて下さい。

βガラクトシダーゼ活性を吸光度で測ったということなら、おそらくサンプルの液量あたりの活性(unit/ml)がわかるんじゃないですか？
Bradford法でタンパク量(mg/ml)がわかったなら、あとはこの二つの値からunit/mgを計算するだけです。

この回答へのお礼

unit/mgの出し方がやっとわかりました。
ありがとうございます。
βgal吸光度/（タンパク吸光度*サンプル量*反応時間）で
βガラクトシダーゼ活性を出しているのですが
これがunit/mlなんですかね？
これを使ってunit/mgを算出してみます。
ありがとうございました。

お礼日時：2008/01/23 23:16

No.5 回答者： guragura77 回答日時： 2008/01/24 22:04

酵母をすり潰して抽出液でβガラクトシダーゼ活性を測っているのかと思っていたんですが、

＞βgal吸光度/（タンパク吸光度*サンプル量*反応時間）

こんな計算でunitがわかるとは思えません。光路長とかモル吸光係数とか計算に出てきませんか？　そういう数値があって、さらに「タンパク吸光度」じゃなく「タンパク濃度」であればunit/mgを求めるという目的に適う式になりそうなんですが。この「タンパク吸光度」が何を指しているのかよくわからないので的外れな事を書いているかもしれません。
βガラクトシダーゼ活性の測定に抽出液ではなく酵母培養液を使っていて、式の「タンパク吸光度」が「濁度」であれば出てくる値はOD600が1の酵母培養液1mlあたりのunit、になるような気がします。

生物分野の計算なんて大して難しい事はしないので、計算の意味を考えてみてはいかがでしょうか。

この回答へのお礼

アドバイスありがとうございます。
計算の方法をもう一度練り直してみて
無事解決することができました。
ありがとうございました。

お礼日時：2008/01/26 20:09

No.3 回答者： stripe-k 回答日時： 2008/01/22 16:17

Bradford法では、BSAは、0.2～1.0mg/mLの範囲で検量線が引けます。

市販の試薬ですと
y(TP)=0.996x(A595)-0.652
R^2=0.999
程度になるはずです。

この回答へのお礼

具体的な数字を出して頂きありがとうございます。
この式を参考に、もう一度やり直すか
グラフを作り直してみようと思います。
ありがとうございました。

お礼日時：2008/01/23 21:50

No.2 回答者： keiii1i 回答日時： 2008/01/22 04:45

すいません　間違いです

Bradford法で総タンパク量を求めるんですね
なので、得られたｍｇ/ｍｌは総タンパク量です

でもunit/ｍｇは酵素活性の実験しないと求めれません
タンパク質1ｍｇ中の酵素量の指標です
酵素もタンパク質ですので。

この回答へのお礼

丁寧な御回答、ありがとうございます。

言葉足らずだったのですが、自分のサンプルのほうは
酵母のTwo-hybrid法を用いてβガラクトシダーゼアッセイ
を行ってスクリーニングして得た未知のタンパクです。

タンパクとβガラクトシダーゼ活性の吸光度をそれぞれ測って
βガラクトシダーゼの相対比活性を算出しました。

unit/mg proteinの単位で出すように言われているので
この場合、βガラクトシダーゼ活性を測ったほうの吸光度を
ｙに入れて計算すれば良いのでしょうか？

お礼日時：2008/01/22 08:16

No.1 回答者： keiii1i 回答日時： 2008/01/22 03:57

ｙ軸に吸光度　ｘ軸に濃度を取ったのならｙに吸光度いれればアルブミンのｍｇ/mlが得られます。

サンプルにアルブミンだけが含まれる場合だけ・・・

Ｕ/mgは酵素の比活性の単位じゃないですか？
血清アルブミンは臨床的にはｍｇ/ｄＬです