PCRのことについて質問なのですが、現在私が行っている細胞から、DNA

PCRのことについて質問なのですが、現在私が行っている細胞から、DNAを抽出しPCRを行うという実験で、うまくいかず行き詰っているので質問させていただきます。

現在以下の条件でPCRを行っているのですが、うまくいきません。

組成
forwardプライマー：1μL（=1pmol/μL）
reverseプライマー：1μL（=1pmol/μL）
Go Taq 5xBuffer：10μL
dNTP：5μL(final濃度で200μM)
Go Taq DNA polymerase：1μL
鋳型DNA：1μL
MgCl2：3μL
滅菌水：28μL
計50μL

反応
・反応
96℃：5分
↓
25サイクル
96℃：1分
55℃：1分
72℃：1分
↓
72℃：5分
↓
4℃：


設計ではPCR産物の長さは約100塩基ですが、これを行うと50塩基のPCR産物が検出され、100塩基のものはまったく確認することができませんでした。
また、プライマーの長さは約20塩基です。プライマーのTm設定はアニーリング温度を55℃と設定して、それよりも+5℃のTm値を持つよう設計しました。

同様の質問をyahoo知恵袋でも行いまして、回答してくださった皆様の条件でも行いましたが、いずれも同じ結果となってしまいました。
http://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question …

また、最近sigma社のXNATR REDExtract-N-AmpTM Tissue PCR Kitの組成液にプライマーと細胞抽出液を入れてPCRを行いましたが同じ結果でした。

原因、改良点の指摘がありましたら是非教えていだけますでしょうか？

No.3 ベストアンサー 回答者： nayu-nayu 回答日時： 2010/11/04 12:57

非特異的バンドが出ても構わないＰＣＲなのか（ゲル切り出し精製可）

シングルバンドでないと後の実験結果に影響を及ぼすのか


なども考慮する必要があるでしょう。

25サイクルの根拠もよくわかりませんし、
とにかく増えればいいＰＣＲで、どうしてもそのプライマー領域でなければだめならば、目的配列より外側でプライマーを設計してnested PCRを行う方法もあります。

この回答への補足

回答ありがとうございます。

これをまた使用して、制限酵素処理するので、シングルバンドでないとダメですね。

補足日時：2010/11/04 16:12

No.4 回答者： nayu-nayu 回答日時： 2010/11/04 16:42

４０サイクル回してみて目的のバンドが出てきたら、そのバンドのみを切り出して

制限酵素処理に回す方法ではだめなのですか？

No.2 回答者： negigi 回答日時： 2010/11/04 11:08

50bpをどう判断したかわかりませんが、そのあたりでモワっと出てるなら、プライマーダイマーですね。

経験的に。

できるなら、PCR条件をいじるよりも、プライマーを再設計するのが早いと思いますよ。

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。

50bpでもわっと出ています。やはりプライマーの再設計が一番いいですかね。

お礼日時：2010/11/04 15:01

No.1 回答者： cpbr 回答日時： 2010/11/04 05:26

前の質問の解答の中にもありましたが、ポジティブコントロールはありますか？出来ればプライマーのポジティブコントロールとDNAのポジティブコントロール両方があるといいのですが。

PCRでいろいろ条件を変えてやってみても上手く行かないときは、プライマーのデザインを変えるしかありませんが、それは可能ですか？（既に論文等に発表されているプライマーを使っているのでしたら話は全く別ですが）

この回答への補足

回答ありがとうございます。

残念ながらポジティブコントロールはありません。
プライマーは論文等で発表されたものではなく、オリジナルです。デザインは変更することは可能だと思います。

補足日時：2010/11/04 14:40