リアルタイムＰＣＲ 定量法

リアルタイムＰＣＲ　定量法について質問があります。通常、ＣＹＢＲＧＲＥＥＮを使って目的遺伝子の増幅値を求める際、デルタデルタＣＴ法を用いてFold inductionを求めると思うのですが、それ以外にもハウスキーピングで値をノーマライズした後、デルタデルタＣＴ法を用いず、Fold inductionではない方法で表を作成する人がいると聞いたのですが、知っている方おしえてください。

No.2 ベストアンサー 回答者： tomoyaok 回答日時： 2007/10/19 15:01

１、サイバーＧで各増幅回数ごとの二本鎖ＤＮＡ量を測定する

（だから、後にどのような解析方法を行うとしてもfold inductionである）

ここからが「解析」に入るわけですが、、、
２、ハウスキーピングで値をノーマライズする。
（どのような解析方法を用いるにしても、この作業をしないと、
ハウスキーピングを増幅対象に用いた理由が生じ得ない）

そして、ハウスキーピングとの比率
あるいは異検体間の目的遺伝子の発現比率
あるいは一検体内での複数の目的遺伝子の発現量比率　を求めるために
３－１　二次微分で増幅開始ポイント（というのかな？）を決定してやる。
（この方法の汎用性が高いのは＃１参照）
３－２　増幅開始ポイントを決定するためのスレショルドを自分で設定する。
（この方法は利点が少ないが、＃１のような事例に対応できる）

という説明をしたつもりですが、私の知識量が足りないことによる理解不足で
かつ、それをあなたが説明することにより私から適切な回答が得られるとあなたが考えた場合は
あなたが補足説明をしてください。それ以外の場合は無視してください。

この回答へのお礼

返信送れてすいません。ありがとうございました。そもそもこの質問をしたのが、うちの研究室のボスが、リアルタイムＰＣＲを全く知らなかった人で、ここ数ヶ月の間にいろいろ説明して理解した（と思う）のですが、どうしてもFold inductionが気に入らず、Fold induction以外の解析方法がなければ、deltCT値を表で使いたいとだだをこねている状態です。しかし、これまで、ペーパーでdeltCT値を使ったデータも見たことないし。困ったもんです。今は、みながやっていないから、やらないというのは理由にならないと、言う始末で、もう好きにしてくれ。といった感じなっています。もっとストレートに言えばよかったですね。

お礼日時：2007/11/02 00:36

No.3 回答者： tomoyaok 回答日時： 2007/11/02 09:22

半分冗談ですが、

では、教授にトヨタの５Ｗを行ってください。
Why×５で、より理解が深まるそうです。
ただ、恋愛マニュアル本にはwhyは会話を中断させる
禁忌の言葉とありますので、教授との関係が悪化しない程度に
お願いします。

この回答へのお礼

結構、みんな呆れているので、今更どうにかしようとも思いませんし、頑固おやじなので、それも不可能かと思います。ただ、レビューされたときに恥をかくのは彼なので、どうでもいいんですが。ともあれ、ありがとうございました。

お礼日時：2007/11/02 10:25

No.1 回答者： tomoyaok 回答日時： 2007/10/19 09:28

二次微分を取るのは定量値に作為を含ませないためであることと、

作為が含まないが故にめんどくさくないことが一般に広くとられていることだと思いますが、
増幅効率が悪いとかの理由でピークの立ち上がりが上記方法に
適していない場合、しかも、立ち上がりポイントが自明であれば
スレショルドを自分で設定してもいいのではないでしょうか。
そういう実験は初期濃度をなんとかするとかプライマーあるいは
プローブの種類を変えてみるとか実験条件の改良が先決の場合が
多いと思いますが、例えば、標準状態より５とか６桁増幅効率が
落ちているんだということをワンバッチで証明したい場合は
自分設定でやらないとだめかもしれません。

この回答へのお礼

ありがとうございます。でも、threashholdの設定ということではなく、得られた結果の解析法について知りたかったのです。実際にプライマーのvalidationなどもほぼ増幅率のスロープも-3.1 から-3,6といい結果が得られています。また、目的遺伝子のＣＴも20後半から30前半とハウスキ-ピング遺伝子も10台後半でいい感じです。つまり知りたいのは、Fold induction以外で遺伝子の発現率を表す方法が知りたいのですが。質問の意味があまり明白ではなかったのかも知れません。

お礼日時：2007/10/19 12:18