細胞に薬剤を入れて、タンパクとRNA合成が
どのように変化するかという実験をしています。
今まで私が所属しているところでは
RIのみ(0.67μM)を加えて一時間インキュベートを
していましたが、これだと取り込み量が少ない
ので、コールドのロイシン、ウリジンを加えようと
いうことになりました。
とりあえず10μMを加えて実験をしなさいと
の支持で実験をしてみたのですが、
適正の濃度ではありませんでした。
もし同様の実験をされている方がいらしたら
加えるコールド(RIでない)のロイシンと
ウリジン濃度を教えていただきたいのですが。
よろしくお願いします。
No.3ベストアンサー
- 回答日時:
>反応をとめて細胞を集め、洗い、細胞のペレットをいきなり5%TCA処理して(界面活性剤はなにも加えません)、それを遠心もせずにGF/F フィルターにトラップさせてそれをカウントしています。
この方法だと、高分子に取り込まれたものだけでなく、膜胞(一番大きいものが細胞膜)に取り込まれたものすべてがトラップされます。フィルターを洗う時の洗浄液を工夫すれば、それでも良いかもしれませんが....この実験だと、取り込み活性の測定を観ているだけのような気がします。面倒でも、細胞破砕のステップを入れる事をすすめます。
例えば、1mM Leu、5% SDSを含むPBSで懸濁して、一定時間インキュベートし、それからTCA沈殿させ(フィルターだけでも良いです)、そのフィルターを1mM Leuを含むPBSで十分洗って、フィルターのカウントを測定してごらんなさい。コールドのロイシンで洗うのは、吸着しているモノマーを交換するためです。タンパク質に取り込まれたLeuは入れ替わりませんから、高分子に取り込まれたホットの量(これが調べたいタンパク質合成量)はそのままで、バックを減らす事ができます。
今測定している、カウントから計算して、通常のタンパク質合成量に合いますか?おそらく、その何十倍かあるのでは?
どうもありがとうございます。
今 上の人たちが不在なので来週実験に
ついて話をしたいと思っています。
もっとおうかがいしたいことが出てくる
と思うので、まだ締め切らずにいさせて
もらいます。
またお願いします。
No.2
- 回答日時:
>培地はES mediunm 2%FBSです。
と言うことは、培地中に既に十分量のLeuは含まれているということですね。それなら、少量のホットのLeuを加えても十分なはずです。
次は、どういう操作をして、何の放射活性を計っていて、それがどうなっているのか?(文章を読んだだけでは、何が悪いのか全く理解できません)説明してください。
ある薬剤を加えた実験系 Iと加えない(あるいは薬剤だけ抜いたものを加える)実験系 IIを比較するとします。 まず、最初に薬剤が細胞の生育に影響があるか調べ、濃度依存性を調べておきます(ここまではやってあるのですね?)。薬剤の効果の何をみたいのかがさっぱり分からないので、想像するしか無いですが、生育阻害が観察できるぎりぎりの濃度で、実験して、実験系I, IIの両方にホットのLeuを加えます。 次に、一定時間後、コールドのLeuを大量に添加して、細胞をプレートから剥離して、遠心で集めます。ここからは、(1)界面活性剤を十分に含んだ溶液に溶かして、SDS-PAGEにかけ、高分子への取り込みをオートラジオグラフィーで観察する か、 (2)界面活性剤で抽出した溶液(軽い遠心でデブリスは捨てる)を酸変性させて、高分子をフィルターでトラップして、トラップされた放射活性をシンチレーターで測定する。 の2つがあり得ますが、(1)の方が実験としては面白いと思います。
想像で手順を書きましたが、実際はどうしているのでしょうか?
この回答への補足
たびたびありがとうございます。
使用している薬剤はmRNAのハイプシン化の
阻害をしるのではないかと考えられています。
薬剤の濃度等は以前の学生が実験をして
論文を出しています。
mRNAの量の違いをみるまえに、total RNAと
タンパク合成量の違いをみようということに
なっています。
薬剤を入れて一時間カルチャー後に、コールドの
ウリジン、ロイシンそれぞれで、反応をとめて
細胞を集め、洗い、細胞のペレットをいきなり
5%TCA処理して(界面活性剤はなにも
加えません)、それを遠心もせずに
GF/F フィルターにトラップさせてそれを
カウントしています。
デブリスっていうのは細胞片ということでしょうか? それごとトラップしています。
これまでもこの研究室ではこういう
方法で実験をしていましたが、どうなんでしょう?
改善すべき点等教えていただけますでしょうか。
よろしくお願いいたします。
No.1
- 回答日時:
培養している細胞は何か?その遺伝子型は?
使用している培地の組成は?
これらが記述されていないと一般論で話をするしかありません。
通常は、ロイシンはNa+とのシンポートで細胞内に輸送されるので、使用している生物のLeu/Na synporter のLeuに対するKmが分かっていれば、その3-5培程度入っていれば十分だと思います。
適正かどうかは、どうやって判断していますか?
この回答への補足
Km値は以前はかったことがあるとかないとか
で、わかりません。
細胞は mouse mammary carcinoma FM3A cellを
つかっています。培地はES mediunm 2%FBSです。
10μMでしなさいと指示をされ、間違えて
一回目は100μM加えてしまいまして、次に
10μMで実験をしたところ、ロイシンに関しては
RIのシンチレーションのカウントがほとんど
変わらないので、100μM以上入れなさいと
次回の実験の指示がでました。
(以前コールドのロイシンを加えなかったときに
比べるとカウントは3分の1下がっています)
ウリジンに関しては、10、100両者とも
コールドを加えないときの実験のときと
カウントが変わらないので、これももっと
増やしてするように言われています。
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