電気泳動について

こんにちは、現在アメリカの大学で分子生物学を学んでいる学生です。

私の所属するラボでは、植物を扱っており、突然変異体を用いた実験を行っています。

先日電気泳動の実験をしたのですが、バンドの読み方と、そもそもなぜ電気泳動の実験をしたかがわかりません。
英語が堪能ではないため、説明をきいてもいまいちわからず、困っています、、、。

サンプルは、ある突然変異を起こしたシロイヌナズナで、供試数は変異体９個体＋野生型１個体です。
プライマーはLB＋RPとLP＋RPという２つのプライマーを使用しています。

分子用マーカの右隣から、LB＋PR使用の個体①、LP＋RP使用の個体①、、②②、③③という様に並んでおり、最後が野生型です。

この写真から、
LB＋PRプライマーを使用するとバンドが現れない。
野生型だと両方のプライマーでバンドが現れない。
LP＋RPプライマーでのバンドも１本だけで、しかも大きい。

以上のことは、なんとなくわかるのですが、、
それが何なんだろう？と疑問に思っています。
メモがヒントになるような気もするのですが、どなたか教えていただけないでしょうか。
よろしくお願いいたします。

No.6 ベストアンサー 回答者： guragura77 回答日時： 2015/11/22 00:16

もう実験のやり直しをしたと思いますが、うまくいったでしょうか。

たぶんホモの変異体を選別したかったんですよね？
実験の意図はラボでの説明がわからないと適当に予想することしかできないので、理解できるように頑張ってください。

＞なぜ２つのプライマーの方向が逆なのか

DNAポリメラーゼは 5' から 3' の方向にしか DNA の合成が出来ないので、互いに逆向きな一本鎖DNA が結合して出来ている二本鎖DNA を PCR で増幅するためには、それぞれの DNA鎖の 5'末端にあたるプライマーが必要だから。
PCR の原理を説明した書籍やウェブサイトはたくさんあるのでよく勉強してください。

この回答へのお礼

やっとわかりました！２本鎖にわかれて、それぞれにくっつくということですね！
絵では１ぽんだったので、混乱しまし！

お礼日時：2015/11/25 00:33

No.5 回答者： guragura77 回答日時： 2015/11/19 20:20

添付されている画像の左上端に→と B、その右に←と RP と書いてあるように見えます。

もっと左の方に→と LP があるんじゃないですか？　その下の長方形がおそらく T-DNA で、T-DNA の Left Border に対するプライマーが LB、シロイヌナズナゲノム上のターゲット遺伝子に対して設計されたプライマーが LP と RP でしょう。
野生型なら LP+RP で PCR増幅が見られ、T-DNA により組換えが起こった変異体なら LB+RP で PCR増幅が見られるようになるのだと思います。野生型で LP+RP の PCR増幅が見られないとすると、入れるプライマーを間違えてるんじゃないですか。

この回答へのお礼

ありがとうございます！！すごく納得がいきました。
まさに仰ると通りです！
勉強不足で申し訳ないのですが、なぜ２つのプライマーの方向が逆なのか教えていただけないでしょうか。

お礼日時：2015/11/20 03:04

No.4 回答者： スチールウール 回答日時： 2015/11/19 02:34

更に戯言で追加ですが

バンドができた は結果なので、考察をしましょう
例えば先ほどの、遺伝子導入が出来ていたと思われる はこの場合考察で良いかと
あとは、オリジナルのベクター①のLB,RB内の遺伝子を取り除き、そこに別の遺伝子を導入してベクター②を作っていると思います
ここで、ベクター①を殺し忘れたら(全てのベクターで上記処理が成功するとは限らないので)、電気泳動はどうなったと思うか
更に殺し忘れて、ベクター②の作成も失敗していたら(要するにベクター①をそのまま試料に感染させていたら)電気泳動はどうなったか
(これで予想される結果と今回の結果を分けるために分子マーカーが使えるかと)
辺りを考えれば楽しいかと

で、この辺りからT-DNAでもあるかは分かりませんが、抗生物質耐性遺伝子の意義(使い方)とかを勉強できたら良いなと思います

No.3 回答者： スチールウール 回答日時： 2015/11/19 02:02

はい、そういうことであっていると思います

組み換えというよりは、導入だと思いますが(導入する際に元の遺伝子を除いたりしていないので)
本気でその辺の言葉遣いはわからないです

ちなみに、私は昔PCRした時に酵素が死んでいて(教官の保管の仕方が悪かった)、遺伝子導入は成功してもPCRに失敗して何もバンドが出ないという悲劇はありました！

No.2 回答者： スチールウール 回答日時： 2015/11/19 01:51

追加

電気泳動ではなくPCRの実験だと思うので、PCRに関してお勉強して下さい
電気泳動はPCRの結果を見る一つの手段に過ぎません
まぁ、あと学生実験ではなく研究室だというのなら、T-DNA(植物への遺伝子導入)に関しても必要なんだと思いますが

化学で薬品混ぜて、何か溶液を作る実験をしていて、最後にリトマス試験紙で中性かどうか調べる実験をしたとします
気にすべきなのは何ができるか、どういう反応をするかの筈なのに、リトマス試験紙の何が楽しいの？と言っているようなものです

No.1 回答者： スチールウール 回答日時： 2015/11/19 01:29

多分ですが、cDNAを作っているのですよね？

で、変異体はアグロバクテリウムとかいうベクターで遺伝子導入されているのかな
専門でないので間違ってるかもしれませんが

まず、プライマーはくっつく相手がいないと無意味です
で、今回のLPとかRPっていうのは、アグロバクテリウムで遺伝子導入された時に一緒に付いてくるものLBやRBに相補的なものなのだと思います

ですので、まずLBその物を入れるのは無意味
LPやRPを入れても、野生型ではベクター導入されていないので、プライマーが結合できずやっぱり無意味
変異体のみでプライマーが結合され、そこからDNA伸長が始まってある長さのDNAが作られます
ちなみに、LPかRPのみだとプライマーがくっつきますが、かなり長いDNA断片が非効率的に作られるだけなので電気泳動で出てきません

電気泳動にかけることにより、試料中に含まれる遺伝子が長さごとに切り分けられます
これで、野生型になかった遺伝子(正確には似た長さの遺伝子)がなかったかどうかを検証できます
今回の場合、野生型がアグロバクテリウムに感染してなかったので、何も楽しくないですが…
2,3種類(の遺伝子を持った)のアグロバクテリウムに感染させるとかすると、バンドが2つ出たり、感染したベクターごとにバンドが出る位置が変わったりします

この回答へのお礼

回答ありがとうございます！
知識不足なせいで自分の中でまだきちんとした整理ができていないのですが、
つまり、今回の場合、野生型に見られないバンドが出現したということは、
LP＋RPで出現する新たなDNAが植物体に入っていた＝組み換えに成功したという事でしょうか？

お礼日時：2015/11/19 01:53