ジデオキシ法(サンガー法)の古典的な方法では、1本鎖DNA、プライマーとともに加えるdNTP(ddNTPではないです)のうちどれかひとつを放射性同位体で標識する、と教科書に書かれていたのですが、どれかひとつを標識するだけでできた断片が全て検出できるのでしょうか?
例えばdATPを標識した場合でも、もし1本鎖DNAが全くTを含まない配列だった場合、dATPは使われないため標識されないんじゃないかなぁ、なんて思ったのですが…
それは極端だとしても、プライマーの隣りの塩基がTではなかった場合、dATPが使われるのは2個め以降になってしまい、一番小さい断片は検出できないのではないかと疑問になってしまいました。
ご存知の方、ぜひ回答して下さるとうれしいです。
No.2ベストアンサー
- 回答日時:
もう10年以上ラジオアイソトープ標識のシークエンスはしてませんので、うろ覚えです。
>例えばdATPを標識した場合でも、もし1本鎖DNAが全くTを含まない配列だった場合、dATPは使われないため標識
>されないんじゃないかなぁ、なんて思ったのですが…
その通りです。もしTを全く含まない配列があったら、全く標識されません。
>それは極端だとしても、プライマーの隣りの塩基がTではなかった場合、dATPが使われるのは2個め以降になってし
>まい、一番小さい断片は検出できないのではないかと疑問になってしまいました。
プライマーというものがシークエンスのためには必要です。で、 ものはシークエンス用のヴェクターに入っています。
ヴェクターの共通プライマーを最初は使いますが、プライマー近辺の配列は解っているので、そもそもそんな短いもの
を検出する必要がないのです。プライマーウォーキングするときも、知っている既知のシークエンスのぎりぎり端にプラ
イマーを設計することはありません。
どのくらいの長さのものを検出するかは電気泳動の時間で決まります。普通の条件だと、確か見え始めるのは数十く
らいからじゃなかったかな・・・、もう少し短かかったかな? 500くらいまでなんとかよんでましたね。
あ、ありがとうございます!!(>_<)
確かにプライマーが作れるんだったら、そんな短いのを読めなくてもOKですよね…!
教科書に説明はないし、ネットでかなり調べても出てこなかったのでほんとに助かりました。
すごく分かりやすかったです。ありがとうございました!
No.4
- 回答日時:
>プライマーの隣りの塩基がTではなかった場合、dATPが使われるのは2個め以降になってしまい
原理的にはそうなります。しかし、当時はPCR普及以前のことで、シークエンスは読みたい配列をプラスミドにクローニングして、M13 primerなどを使ってマルチクローニングサイトの外側から反応させるのが一般的でした。実際には、伸長開始直後のプラスミド由来の配列に標識が入りますので、必ずしも目的の配列が一塩基目から検出できないということではありませんでした。長い配列を、配列内部のprimerで読み進むときも、既知の配列と十分なオーバーラップを取りますので、最初の数塩基が読めなくても目的は達します。
このように、標識dNTPが伸長反応で取り込まれることによる標識を内部標識(internal labelling)と言いますが、別法としてプライマーの末端を放射性リン酸化して標識する、末端標識(end-labelling)もあります。これなら原理的にプライマーの次の一塩基目から検出できます。内部標識より、よっぽど面倒くさいのでめったにやることではなかったですが。
>1本鎖DNA、プライマーとともに加えるdNTP(ddNTPではないです)のうちどれかひとつを放射性同位体で標識する、
ふつうはdCTPに標識したものを使います。比活性を調整するためにcold(非標識)のdCTPと混合する場合もあります。放射性dNTPは安全性の上でも経済的にも多量に使うわけに行かないので、反応時の濃度を薄めにせざるをえません。dCTPはほかのdNTPより低い濃度でもポリメラーゼの基質となりえるので、標識dCTPを使うのがいいのです。
おぉぉ、そうなんですか…!
プライマー近辺は読めなくても問題ないように、色々と考えられてるんですね。
末端標識は面倒くさいんですね(笑)確かに内部標識なら、ラベルされたものを入れるだけだから楽そうですね~(笑)
dCTPのこともすごく参考になりました!回答ありがとうございました☆
No.1
- 回答日時:
サンガー法は4種類をddNTPごとに4回行います
例えばTATGCTACとすると
ddATPを入れた時
A
ATA
ATACGA
ATACGATG
と4つの断片が生じます
次にddTTP
AT
ATACGAT
ATACGATG
と3つの断片が生じます
ddCTP ddGTPそれぞれに行い電気泳動をおこなれば
A
AT
ATA
ATAC
ATACG
ATACGA
ATACGAT
ATACGATG
と大きさ順に並ぶはずです
これによって塩基配列が決定されます
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
似たような質問が見つかりました
- 大学受験 国立受験 11月からの大逆転劇を起こすには 7 2022/11/14 19:24
- 地図・道路 高速道路の80キロ速度標識の間の区間、走行可能速度は80キロ?100キロ? 1 2022/10/04 21:39
- その他(車) 指定方向外進行禁止の道路標識 3 2023/05/03 23:55
- その他(法律) 2車線以上であっても、歩行者は横断歩道がない道路を横断できますよね? 3 2022/04/19 15:58
- 運転免許・教習所 標識の有効範囲について教えてください 8 2023/07/02 08:32
- Excel(エクセル) Excel VBAについてです。 少しだけ知識はあるのですが、 うまくいかなかったので 質問させてい 3 2022/09/13 18:40
- 憲法・法令通則 「止まれ」の標識も車線境界線も無い側道合流部 1 2023/06/09 15:00
- 高校 生物の問題で下の塩基配列は、DNAを構成する2本のヌクレオチド鎖のうち、一方の塩基配列の一部を示した 2 2022/05/08 17:01
- バイク免許・教習所 原付(50CC)の二段階右折について 4 2023/07/18 21:49
- その他(悩み相談・人生相談) 「止まれ」標示って止まらないと駄目ですか? 8 2022/04/25 13:03
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
-
DNA塩基配列から推定されるアミ...
-
遺伝子操作
-
ライゲーションと脱リン酸化
-
Sau3AIとBamHI
-
遺伝子の塩基配列の問題がわか...
-
酵母のgenotype表記について
-
長さNヌクレオチドのDNAで、幾...
-
突然変異(転座・逆位・欠失・...
-
系統樹の読み方について
-
真核生物vs原核生物
-
ゲノムDNAの質の検定の為の、ア...
-
PCR法について
-
ヒトのGC含有率はいくらですか?
-
Alu配列って何?
-
DNAの超らせん構造の生じる原因...
-
ダイデオキシ法におけるプライ...
-
アイソトープの原理
-
DNAポリメラーゼとRNAプライマ...
-
PCRの種類について
-
生物の二重鎖のDNA の続きです
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
-
DNA塩基配列から推定されるアミ...
-
cos末端とは何ですか?DNAの端...
-
遺伝子操作
-
HBVの「マイナス鎖」と「プラス...
-
Primer3のLeftとRightの方向
-
2つのシークエンスによる結果の...
-
系統樹の読み方について
-
DNA断片のシークエンス結果の読...
-
DNA
-
Shine-Dalgarno...
-
アルカリSDS法におけるDNAと...
-
PCR増幅産物のbp
-
Poly(IC)とは
-
ハイブリダイゼーションとアニール
-
遺伝子の塩基配列の問題がわか...
-
Swiss-ProtでTranslateした結果...
-
アリル特異的PCR法の原理を教え...
-
RAPD法とAFLP法について
-
PCRの 5’・3’ が分からず困っ...
-
leading鎖のプライマーはどうな...
おすすめ情報