シクロヘキシミドを用いた実験について

ヒトの細胞を用いて、ある刺激により、ある遺伝子のmRNAの発現誘導がprimary responseかsecondary responseであるかを、翻訳阻害剤であるシクロヘキシミドを用いて評価できないかどうか検討しております。
予備実験でヒトの細胞をある条件で刺激した時にシクロヘキシミドを濃度を振って(0, 0.5, 1, 5 μg/ml)添加し、Annexin-V/PI染色を行ったところ、低濃度のシクロヘキシミドでもapoptosisが明らかに上昇してしまいました。
このような場合、シクロヘキシミド自体による細胞毒性が認められため、最初に記載したようなprimary responseかsecondary responseかを評価するのには不適切だと思うのですが、いかがでしょうか。

No.2 回答者： yoshik99 回答日時： 2011/12/09 09:15

私もまったく同じことで悩んでいまして、こちらを拝見しました。

回答者様の説明が研究初心者のため、理解するのが難しく、
改めて質問をさせていただきたいのですが、コントロールはどのようなものを
おいたらいいのか、短時間というのはどれくらいなのでしょうか？
私の場合はsecondary responseを証明したいのですが、
他に証明する手技はどんなものがあるのでしょうか？

No.1 回答者： larme001 回答日時： 2011/07/03 18:50

　結局はケースバイケースと、その実験を全体のなかでどのような位置づけで用いるかが重要だったりする気もします。

　シクロヘキシミドで新生タンパク質の合成を阻害したことによってアポトーシスが起きるといっても、要するにそれがその刺激による現象を見る上で問題とならなければよいわけですよね。比較的短時間ならあまり問題にならないような気もしますし、きちんとコントロールをおいて、気になるならその刺激依存的に上がると知られる因子がきちんと動いているという条件でやればそれほどアポトーシスが起こるかどうかが問題ともいえない気がします。

シクロヘキシミドで抑制がかからないならprimary response（タンパク質の合成を介さない）可能性が”高い”と言えるでしょうが、仮に上がらなかったからsecondary responseと単純に結論づけるのは個人的には少し抵抗ありますが。サイクルが早い転写因子とか、そういうのが関与している場合そもそもシクロヘキシミドだけで抑制がかかりそうな気もしますし。いずれにせよ目指すレベルにも夜と思いますが、関与している因子が直接的なターゲットでimmediate early responseな上昇が期待されるようなときには確認してみる実験はcellクラスの論文でも見たことありますし、いずれにせよprimary responseを示すならその刺激依存的な結合サイトによる転写活性とかで直接示す必要があると思うので、その前段階としてやるならいいと思いますけどね。

ラボのミーティングレベルで議論するなら、それほど大変でもないですからやってみて結果とともに「アポトーシスがかなり起きる」という前提で議論すればいいのでは？