配列決定について

Question

いつもお世話になっております。
関連の本を読みましたが、よく分からなかった部分がありました。いくつか教えて下さい。

1.　ゲノム配列を決定する際に用いるショットガン法では、ランダムに切断した断片をベクターに導入し、ベクターの既知配列部分をプライマーとして挿入断片の両端から配列決定していき、他の断片との重複から元のゲノム配列を決定する‥‥ことでしょうか。とすると、重複部分を生むために、もとのゲノムDNAは複数用いているのでしょうか？あるいは、ある一個のゲノムに対して、断片化から配列決定までの作業を行い、再度同じ作業を行なっているのでしょうか？
　また重複領域がみつからないと断片のつながりが分からないし、かと言って重複ばかりでは全体が見えないという点で、素人ながら効率が悪いようにも感じてしまいます。

2. cDNAの操作について
精製タンパク断片のアミノ酸配列からオリゴヌクレオチドプローブを作り、cDNAをスクリーニングして、精製タンパクの断片からプライマーを設計してPCRする例が私の教科書にはあるのですが‥‥スクリーニングできたcDNA入りベクターの既知配列(MCS？)をプライマーに使ってPCRするという方法は間違いなのでしょうか？

基本事項ばかりですいません。プロトコールのサイトや本をご存知の方、あるいは一部の回答でもかまいませんので、教えて下さい。

geneticist12 · Accepted Answer

１のご質問に答えて、

ゲノムDNAといった場合、1コピーというわけではないことはわかりますよね。生物から抽出するのですから、大雑把にいって、そこに含まれている核の数だけ（二倍体ならさらに倍）のコピー数があるわけです。仮に2 マイクログラムのヒトゲノムDNAから、ゲノムライブラリーをつくるとします。ヒトのゲノムサイズが約3 Gb、分子量が約2 x 10の12乗ですから、2 マイクログラムは1 x 10のマイナス18乗mol、これにアボガドロ数をかけて、ざっと10万コピー以上のゲノムDNAがふくまれていることになります。これを酵素や超音波でランダムに切断するので、ずべてのコピーが同じところで切れるということはまずないのです。ですから、よっぽどのことがない限り、かならずオーバーラップはとれるのです。

ゲノムプロジェクトで、ショットガンをやる場合、読んだ全塩基数がゲノムサイズの2-3倍、ときには10倍くらいになるようにします。ヒトゲノムでいうなら最低でも10 Gb分くらい読むのを目標にします。そうすることで、ランダムなDNA断片を読んだとしても、一度も読めなかった領域というのがきわめて少なくなるのです。
また、真核生物のゲノムサイズは大きいので、いきなりショットガンでシークエンスはしません。まずゲノム全体をカバーするBAC, Cosmidを用意して、それらをそれぞれショットガンシークエンスすることで、サンプリングの偏りが少なくなるようにしています。

geneticist12 · Answer

２のご質問について

タンパク質の分析をスタートにして、cDNAのクローニングをするための２つの異なる戦法について記述しているのだと思います。すなわち、

1.アミノ酸配列から、オリゴDNAプローブを設計して、cDNAライブラリーをハイブリダイゼイションでスクリーニングする（PCR普及以前によく行われていた）。

2. アミノ酸配列から、PCRプライマーを設計して、RT-PCRをする（こうして得られたcDNAは、全長のうちごく一部分なので、さらに、これをプローブにしてライブラリーをスクリーニングしたり、RACEをして全長をとる。PCR普及後はこっちの方がポピュラー）。

そのほかにも、精製したタンパク質で抗体をつくり、発現ライブラリーを抗体反応でスクリーニングする方法もありますね。


蛇足ですが、ベクターにクローニングしたDNAをシークエンスするときは、MCSの数十塩基そとがわの配列に対応するプライマーをつかいます。

配列決定について

１のご質問に答えて、

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