ロングプライマーでのPCR

通常のPCRは20mer程度のプライマーで行います。しかし、現在実験の過程で70merのプライマーを使ってPCRをしようと考えています。これほど長いプライマーでPCRは可能でしょうか。また、可能ならPCRを行う段階での注意点を教えていただけないでしょうか。ちなみに、TM値を計算したところforward、reverse共にTM値が71でした。

No.3 回答者： MIYD 回答日時： 2007/02/15 22:07

変性と、アニール＆伸長反応の2段階で行うという意味です。

No.2 回答者： rimgojam 回答日時： 2007/02/10 21:10

可能ですが、精製されたプライマーを使用することをおすすめします。

(ゲル精製)70merで注文しても、ほとんどの分子がそこまで長くないです。
通常よりも特異性が高いので、伸び難いので、工夫してみる必要があると思いますが、tm値が71度と高いなら2stepPCRがいいと思います。ただ、TM値はあくまでも目安なので、実際にグラディエントをかけたほうがよいです。

No.1 回答者： MIYD 回答日時： 2007/02/10 12:41

two step PCRで出来ると思います。

アニーリングと伸長反応を72℃で、
増やしたい長さと使う酵素に応じた時間をかけます。

増えない場合には、アニーリング温度を少し下げることもあります。

注意点は、プライマー合成時に十分に反応していないものがでてきて、
プライマーがデリーションしていたことがあります。

この回答へのお礼

返答が遅くなって申し訳ありません。回答ではtwo step PCRでできるとのことでしたが、RT-PCRを行うということでしょうか。

お礼日時：2007/02/14 10:41