電気泳動　CBB染色　脱色液方法について

Question

理系大学生です

電気泳動のCBB染色後の脱色液のことで二つ質問があります

脱色液の組成について、一般的にはエタノール(またはメタノール)約25%、酢酸約7.5%を用いられますが、5%程のTCA溶液を代わりに用いてはいけないでしょうか

と言いますのも、低分子のタンパク質の染色が悪いのでこのように脱色液の組成を変更したところ染色できるように成りました。しかし、染色結果を定量的に評価する際に問題ないのかが分かりません

二つ目は、有機溶媒を溶かした脱色液である程度脱色を行った後は、蒸留水を用いて脱色をしてはいけないのでしょうか

よろしくお願い致します

browntraut · Accepted Answer

No.2です。

定量精度低下には繋がらないでしょう。
5%TCAで精度が疑われるのなら、通常の脱色液（エタノール＋酢酸）でも然りです。

もちろん、染始めや完全に脱色してしまった後は精度云々の話ではなくなります。

脱色は、タンパク質がない部分のバックを減らすのが目的ですので、バックが無視できる濃さ
（バンドがキレイ確認できる濃さ）になれば、定量することができるでしょう。

CBBのバンドを定量するのは、主に目玉ですが、バンドの濃さと太さを定量してくれるソフトもありますね。
データを客観視するなら、このようなソフトを使うのが良いと思います。
CBBやウェスタンのバンドを定量化してグラフを描いたりしている論文もありますが、バンドを囲う時にバイアスも多少かかるでしょうから、あくまでCBBでの定量は、「バンドの定量値」としてお考えになるのが良いと思います。

バンドが複数で目的のタンパク質にタグが付いているならタグによる精製、分子量が違うならゲル濾過後に定量、トータルタンパク量で良いならUVやBCA基質でのタンパク質定量もできます。

CBBでの定量だけに拘らず、他の方法でも目的のタンパク質を定量できるのであれば、定量することをお勧めします。
その方が人を説得させられるし、先入観のない正しいデータを出すことができます。

ではでは、頑張ってください。

browntraut · Answer

２種のご質問に対し、いっぺんにお答えします。

まず、脱色したい溶液にCBBが溶解可能かどうかを調べる必要があります。
容易に溶けるのであれば、その溶液を脱色液にすることは可能でしょう。

つまり、5%程のTCA溶液にCBBがグングン溶けるのではれば、可能ということになります。

たしか、CBBは水にあまり解けなかったのではと思います。
机についたCBBのシミを落とすのも、水よりはエタノールの方がすぐに拭えますからね。

つまり、蒸留水を脱色とするのはあまり賢明ではないということになります。
熱水だと多少はマシかもしれませんが、アクリルアミドゲルが脆くなるので、そこは注意です。

shitaba · Answer

TCA溶液ってタンパク質の変性作用がとても強いので、
そんなものを使ったら定量分析にならないように思います。

CBB染色の感度が弱いのであれば、より感度の高い銀染色
を検討すべきではないでしょうか。

電気泳動 CBB染色 脱色液方法について

No.2です。

２種のご質問に対し、いっぺんにお答えします。

TCA溶液ってタンパク質の変性作用がとても強いので、

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