はじめてお世話になります。
通常のPCR時におけるプライマー設計は理解できるのですが、RT-PCRにおいては、はじまりが1本鎖のcDNAであるということでひっかかりを感じます。

cDNAの塩基配列がわかっていますのでそれをもとに遺伝子解析系のソフトを用いてプライマーを設計したところ、sense-primerの配列が、cDNAの相補鎖となるものと相補的になっていました。(anti senseのほうはcDNAと相補的だったのですが)

実験書を読むとsenseがまずcDNAとアニールして2本鎖になってから通常のPCRがはじまるというふうに理解できましたので、上記のプライマー設計ではPCRがおこらないということでしょうか?

この場合はcDNAの相補鎖に対してプライマー設計をおこなえばよいのでしょうか。
それともこのままのプライマーでよろしいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

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A 回答 (1件)

そのままのprimerで問題ありませんよ。


RT-PCRではsense、antisense両方のprimerが
反応液中に存在する訳ですから、
ご自身でおっしゃっている通り、PCRの最初の伸長反応でcDNAは2本鎖になります。あとは、通常のgenomic PCRと同様な過程になるわけです。

cDNAが一本鎖であることに気をつけなければいけないのは、
同一領域でsenseとantisenseの両方向にcDNAが重なるようにcodeされている領域で、
片側のmRNAを特異的に検出しようとする場合のmRNAをcDNAに逆転写する際のprimerです。
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この回答へのお礼

ご丁寧な回答有難うございました。このままの設計で行います。

お礼日時:2005/04/06 08:43

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(2)2つのプライマーの長さは,違っていてもかまわないので,Tmを近づけてください.

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アプリケーションマニュアルもご専門にあわせてどうぞ。

http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/product/ctlgpage.jsp?PLCD=46

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