はじめてお世話になります。
通常のPCR時におけるプライマー設計は理解できるのですが、RT-PCRにおいては、はじまりが1本鎖のcDNAであるということでひっかかりを感じます。

cDNAの塩基配列がわかっていますのでそれをもとに遺伝子解析系のソフトを用いてプライマーを設計したところ、sense-primerの配列が、cDNAの相補鎖となるものと相補的になっていました。(anti senseのほうはcDNAと相補的だったのですが)

実験書を読むとsenseがまずcDNAとアニールして2本鎖になってから通常のPCRがはじまるというふうに理解できましたので、上記のプライマー設計ではPCRがおこらないということでしょうか?

この場合はcDNAの相補鎖に対してプライマー設計をおこなえばよいのでしょうか。
それともこのままのプライマーでよろしいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

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A 回答 (1件)

そのままのprimerで問題ありませんよ。


RT-PCRではsense、antisense両方のprimerが
反応液中に存在する訳ですから、
ご自身でおっしゃっている通り、PCRの最初の伸長反応でcDNAは2本鎖になります。あとは、通常のgenomic PCRと同様な過程になるわけです。

cDNAが一本鎖であることに気をつけなければいけないのは、
同一領域でsenseとantisenseの両方向にcDNAが重なるようにcodeされている領域で、
片側のmRNAを特異的に検出しようとする場合のmRNAをcDNAに逆転写する際のprimerです。
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この回答へのお礼

ご丁寧な回答有難うございました。このままの設計で行います。

お礼日時:2005/04/06 08:43

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http://www.kochi-u.ac.jp/~tatukawa/edu/semc3/2001/b0sb092/92pcr4.html
http://www.gifu-u.ac.jp/~suzuki/Lecture05/PCR/PCR.html

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参考URL:http://www.clontech.com/clontech/techinfo/manuals/PDF/PT1115-1.pdf

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(2)2つのプライマーの長さは,違っていてもかまわないので,Tmを近づけてください.

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Qホルツ プライマーについて

現在、400ccバイクのテールカウルを塗装するため、まず最初の塗装をペーパーで剥がし、その後プライマーを塗ろうと思いますが、プラサフの方がいいのでしょうか?

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あのう、キットの名前ですが、
SuperScript First-Standard Synthesis System for PCR
ではなくて
SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR
ではないでしょうか?

Standardではなく、Strandでは?

それならば、キットの取説はダウンロードできます。
http://www.uccs.edu/~rmelamed/Lab/Protocols/Superscript%20Protocol.cfm.pdf

さらに、その取説の6ページ目には
どういう作業を行うか図があります。

そもそも、理解としては、一本鎖でも二本鎖でもcDNAと呼びます、

が、

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あのう、キットの名前ですが、
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QPCR、プライマーとDNA複製について

PCRでは、5'プライマーと3'プライマーが必要だと思うのですが、これは、2本鎖DNAのそれぞれにくっつくだけ、と理解しています。

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ご存知の方、よろしくお願いいたします!!

Aベストアンサー

ずれてる…orz まあそこらへんは読み取ってください

Qleading鎖のプライマーはどうなるの?

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(3'→5'ポリメラーゼ活性がある酵素でもあれば別ですけど、多分無いですよね)

少しうーんと考えて思いついたんですが、複製起点を挟んだleading鎖の向こう側にはlagging鎖があるから、そっちの3'末端から5'→3'ポリメラーゼ活性で連結するんですかね。

詳しい方いらっしゃいましたら、よろしくご教授願いますm(_ _)m

Aベストアンサー

>複製起点を挟んだleading鎖の向こう側にはlagging鎖があるから、そっちの3'末端から5'→3'ポリメラーゼ活性で連結するんですかね。

はい、基本的にそのとおりです。
No1さんの回答に補足しますと、通常の複製を行っているのは大腸菌ではDNApol(3)なんですが、RNAプライマーにぶち当たるとpol(1)と交代します。pol(3)には二重鎖を形成している核酸の5'→3'exonuclease活性はないんです。
pol(1)は、RNAを除去しつつ、DNAを合成するので、見かけ上ニックが5'→3'方向に動いているように見えます。これが、ニックトランスレーションです。
(translate ≒ move の意味もあります)

ちなみに、PCR用のDNAプライマーなどを人工的に合成するときは 3'→5'方向に行うそうです。 ポリメラーゼは使わずに。