![](http://oshiete.xgoo.jp/images/v2/pc/qa/question_title.png?e8efa67)
先輩から目的遺伝子が組み込まれたplasmidを、
competent cellに感染させ、増やして欲しいと
言われ実験をおこなっています。
しかし、コロニーピックアップし一晩培養した
培養上清を回収し、QIAGENのキットでプラスミドDNAの
抽出をおこなったのですが、全てDNAが10ng程度しかなく、
困っています。
私の考えでは、抗生物質含有の培地のコロニーを
ピックアップし、さらにスケールアップする際も
抗生物質含有の培地で培養したので、プラスミドDNA
が入っていないとは考えられないのですが、、、。
今のところ、キットでタンパク沈殿させた際の
DNAの濃度をはかり、プラスミドの増殖をチェックし
ようと考えています。(キットの操作には間違いは
ありませんでした)
何か、考えられる原因があれば詳しい方お教えください。
ちなみに今までの実験の流れは、以下のように行いました。
1.plasmid DNA(invitrogen pcDNA3.1)を
one shot competent cellに感染させる
2.アンピシリン含有LB培地によりセレクション
3.コロニーを一晩5mlのアンピシリン含有LB培地で培養しスケールアップ
4.1mlの上清回収し、プラスミドDNA抽出
No.4ベストアンサー
- 回答日時:
invitrogen pcDNA3.1は大腸菌へのダメージが大きい場合が多く(理由はわかりません)、ちゃんと大腸菌が増えてもplasmidを落としていることがあります。
competnet cellをHB101のようなよく増える株に変えてやるとか、Ampのかわりにカルベニシリン(carbenicillin)を使用すると良い場合が多いです。とりあえずいろんな操作が不安であれば、まずplateに生えたコロニーをPBSなどを少量かけてからスクレパーでカキとってmini-prepします(今のkitで問題ありません)。plate状でコロニーになっていればほとんどの場合plasmidを落とすことがありませんので、とにかくそれで確認後、ちゃんとplasmidがあれば上記の抗生剤や株をかえることを試してください。もしそれでもだめな場合はplateを何枚も用意してplateで増えた分を回収してとれるだけとってkitでとります。スマートではありませんが先輩にせかされるのであれば一番近道です。この回答への補足
夜遅く、朝早く?ご回答有り難うございます。
plasmidの脱落ですか。そういうことも、あるんですね。
plateに生えたコロニー中にプラスミドDNAがあるかを
チェックする方法で、コロニーからmini-prepをする方法を
教えて頂きましたが、このスケールからどのくらいDNAは
取れる物なんでしょうか?
方法としては、コロニーピックアプし、
一部を滅菌水などに落とし遠心により集菌し、
キットのプロトコルどおり行えばいいのでしょうか?
本を読んだら、コロニーからPCRする方法で
確かめる方法もあるようですが、、、。
すいません、質問だらけで。
No.3
- 回答日時:
大腸菌の中のプラスミドが少ないのか、
カラムの問題かわからないので、
5ml中1ml分しかカラムにかけないのでしたら、
先に1mlをアルカリSDS法で取ってみてはいかがでしょうか。
インサートが大きいプラスミドでしたら、
そのくらいの収量しかないのかもしれません。
前に増やした人に確認して、
場合によっては1~2Lくらい振ることになるかもしれません。
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