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こんばんは。
初めて質問します。よろしくお願いします。

大腸菌のトランスフォーメーション実験を行い、アンピシリンとX-gal染色によりセレクションしました。
白色コロニーをコロニーPCRにかけるために選ぶ際、指導者に、サテライトコロニー(?)は白色でも正しくトランスフォーメーションされていないことが多い、と言われました。
サテライトコロニーとは、1つの大きなコロニーのまわりに小さな飛び散ったようなコロニーが見えるもののことを指すらしいのですが。
なぜ、正しくトランスフォーメーションされていないのでしょうか?確かにコロニーPCRでは増幅されませんでした。
指導者はその理由は忘れてしまったそうです(-_-メ)
調べても中々わかりません。
どなたかご存知でしたら教えてください。
参考URLでもかまいません。
よろしくお願いします。

A 回答 (2件)

サテライトコロニーは、形質転換体のコロニーによって、培地中の薬剤が分解されたために、形質転換されていない(つまり、プラスミドを持っていない)ものがコロニーを形成してしまう現象です。



プラスミド自体を持っていないので、β-ガラクトシダーゼ活性も持ちませんから、コロニーの色は白色となります。

ちなみに、サテライトコロニーは、アンピシリン耐性で選抜するときによく見られますが、アンピシリンの代わりにカルベニシリンという薬剤を使うと、サテライトコロニーの発生をかなり抑えられます。(カルベニシリンは、アンピシリンと比べるとかなり高価ですが。)
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この回答へのお礼

なるほど!そういうことだったんですね。よくわかりました。ありがとうございます!

お礼日時:2004/12/07 10:15

No.1の方とほとんど同じ回答になりますが。



アンピシリンは、大腸菌を殺してしまうことはなく、ただ生育(増殖)を阻害する効果しかないそうです。
そのため、アンピシリンを含んだ培地では耐性をもった(形質転換されてプラスミドを持っている)大腸菌しか育たないのですが、形質転換されなかった菌も増えないだけで生きているのです。

時間がたつとアンピシリン耐性菌によってアンピシリンは分解されて濃度が下がります。すると、そこにはこれまで増えることができなかった耐性を持たない菌体が増殖し始めるのです。

抗生物質には、菌を殺してしまうものと増殖を抑えるものとがあり、殺してしまうタイプの抗生物質では、サテライトコロニーの出現はかなり少なくなります。
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この回答へのお礼

抗生物質の作用の仕方に違いがあるとは知りませんでした。なるほど~。次回に活かしたいと思います!ありがとうございました。

お礼日時:2004/12/07 10:19

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Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

Q大腸菌の形質転換とアンピシリン

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ここで、培地にアンピシリンを添加する理由を教えていただきたいのです。
LB寒天培地にアンピシリンを添加するのは、プラスミドを導入した大腸菌のみを培養するためだと思います。
では、坂口フラスコでの培養でアンピシリンを添加するのはなぜでしょう?自分なりにいろいろ調べたところ、「プラスミドを抜け落ちないようにするため」ということを知りましたが、これはどういうことなのでしょうか?
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ご存知の方は教えて下さい。よろしくお願いします。

Aベストアンサー

プラスミドには目的遺伝子+抗生剤耐性遺伝子(この場合アンピシリン耐性遺伝子)があるはずです。

1.コロニーを採取するまではアンピシリンが必要なのはわかりますね。プラスミドを持っているE.coliだけが生えるようにしているのです。

2.次に大量培養(まあ大量でなくてもいいのですが)、LB brothで培養するときには何がおきるでしょうか。

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ご参考になりましたら幸いです。

Qアンピシリンの失活温度について

アンピシリンの失活温度について教えてください。

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オートクレーブ後の三角フラスコに入っているLB培地に、いつアンピシリンを添加すればいいのかわかりません。

僕の場合は、三角フラスコをクリーンベンチ内で両手で触って円を描くように揺らしてみて、手をつけてられる熱さまで冷ましてから入れるようにしています。

宜しくお願いします。

Aベストアンサー

私も学部生の頃に同じことを考えましたが。。。結論は結構微妙なところだと思います。アンピシリンは酵素のように高温になると変成していっぺんに失活する訳ではなく、高温になるほど分解の進みが早くなるわけですよね。(もちろん1時間くらい煮沸すればかなり失活するかもしれませんが。。)。というわけで、結局実験的にできるだけ影響が起きない(しかし、ゲルが固まらない)ような妥協点の温度でやるために手で触れる=約60℃で添加することがスタンダードになってるわけです。

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Qサテライトコロニー内の菌の形質について

おはこんばんちわ。
高校の授業で遺伝子工学の実習をやっているのですが、
どうしても気になることがあったので、質問させていただきます。

大腸菌にpUC19を導入し、アンピシリンとX-gal・IPTGによる大腸菌形質転換の実験を行いました。

その後、アンピシリンを含んだ培地で数日間培養したところ、青色のコロニーの周囲に白のサテライトコロニーが確認できました。

コロニーの色が変化しなかったことから、サテライトコロニー内の大腸菌ではLacZが働いていないという結果になりました。

この時、サテライトコロニーの大腸菌は完全にpUC19を含まないものだと証明できるのでしょうか?
仮説の証明としてレポーター遺伝子をpUC19に導入するという実験方法を考えましたが、予想される結果には遺伝子が正しく導入されていない可能性も含んでしまうと言うことで、完全には証明できない、とのことでした。

サテライトコロニーが起こる理由と考えられる全ての例を挙げようとすると、無数の実験をしなければいけないということになると思うのですが…
これは証明できる方法があるのでしょうか、もしくは完全には証明できないのでしょうか。どなたかご存知でしたら教えてください。よろしくお願いします。

おはこんばんちわ。
高校の授業で遺伝子工学の実習をやっているのですが、
どうしても気になることがあったので、質問させていただきます。

大腸菌にpUC19を導入し、アンピシリンとX-gal・IPTGによる大腸菌形質転換の実験を行いました。

その後、アンピシリンを含んだ培地で数日間培養したところ、青色のコロニーの周囲に白のサテライトコロニーが確認できました。

コロニーの色が変化しなかったことから、サテライトコロニー内の大腸菌ではLacZが働いていないという結果になりました。

この時、サ...続きを読む

Aベストアンサー

たぶんサテライトコロニーにpUC19は入っていません。
経験的に答えを知っているのですが、証明法をお望みのようなので、決定的な言葉は控えます。

pUC19によるアンピシリン耐性はβラクタマーゼによるものです。
βラクタマーゼとは、抗生物質であるアンピシリンを分解する酵素です。
pUC19が入っている大腸菌は、培地中のアンピシリンを分解します。
つまり、pUC19が入っているコロニーの周囲のアンピシリンは・・・

ではなぜ、pUC19の入っていない大腸菌は即座に殺菌されなかったのか。
アンピシリンなどのβラクタム系抗生物質は、細胞壁合成を阻害し、分裂を抑制します。これを静菌作用といいます。
したがって、耐性を持たない大腸菌の生命活動を即座に止める(殺菌する)ものではありません。
つまり、周囲のアンピシリンさえなくなれば、耐性を持たない大腸菌も・・・。

なお、レポーター遺伝子の考えもとても良いと思いますが、結果的にpUC19に含まれるX-galによって誘導されるガラクトシダーゼと同じことになると思います。
証明法としては、たとえば選択に用いる薬剤とプラスミドのマーカー遺伝子を、殺菌作用のある他の抗生物質に変えてみるとか、青いコロニーとサテライトコロニーから同じ操作でプラスミド抽出を試みて、どちらにプラスミドが入っているか確かめるか、などいかがでしょうか。

たぶんサテライトコロニーにpUC19は入っていません。
経験的に答えを知っているのですが、証明法をお望みのようなので、決定的な言葉は控えます。

pUC19によるアンピシリン耐性はβラクタマーゼによるものです。
βラクタマーゼとは、抗生物質であるアンピシリンを分解する酵素です。
pUC19が入っている大腸菌は、培地中のアンピシリンを分解します。
つまり、pUC19が入っているコロニーの周囲のアンピシリンは・・・

ではなぜ、pUC19の入っていない大腸菌は即座に殺菌されなかったのか。
アンピシリンな...続きを読む

Q液体培地で培養すると大腸菌が生えてこないんです。

当方、実験初心者です。初歩的な質問になりますが、よろしくお願いします。

目的遺伝子をインビトロジェンのTOPOベクターに組み込み、自作のコンピテントセル(XL10)にトランスフォームし、アンピシリン(Amp)入り寒天培地にまきました。
そこで生えたコロニーをピックアップしてLB+Ampに植菌しましたが、全く増えてきません。液体培地をTBに変更してみましたが、効果はありませんでした。
Amp濃度は100μg/mlです。
この問題を解決する方法がございましたら、お教えください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

初心者、を前提に回答させていただきます。

まずは以下の点を、再確認してみてください。
1)プレートを作製するときに、培地が熱いうちにAmpを入れませんでしたか?またはプレートが古すぎはしませんか?
→Ampは結構不安定なので、AmpRで選抜するならCb(50ug/ml)を使ったほうがいいかもしれません。またTOPOならKmRもあったとおもうので、Cb, Km両方入れてはいかがでしょう?プレートに入れたAmpが死んでいて、プラスミドを持たないのに生えてきたコロニーを拾ったのかもしれません。

2)液体培養する前にプレートのコロニーに対しダイレクトPCRなどをして、目的配列・プラスミドの導入を確認しましたか?
→目的配列が入っているようなら1)の心配もたぶんないと思います。

3)プレートでの培養、あるいはその後の保存は適切でしたか?
→死滅期近くになるほどに培養するとプラスミドをリリ-スしてしまったりします。

Qコロニーが現れない

形質転換って失敗することあるんですか?

プレートの作り方がまずかったのでしょうか。

コンピテントセルを扱うときにコンタミは
そこまで致命的なものなのですか?
クリーンベンチでやった方がいいのでしょうか?

抗生物質の耐性を獲得して大腸菌が生えてくるはずなぜか生えてきません。

形質転換はclonaseという酵素を使って遺伝子を組み替えてから行っています。

Aベストアンサー

ストラテジーはま、方法みたいなもんです。制限酵素認識部位を見逃してないかとか、ちょっとした見落として理論的には不可能なことをしていないかということです。

コンタミはさほど気にしなくていいです。クリーンベンチを使うほど厳密な無菌操作をやっているラボは少ないのではないかと思います。回りの人でファージを使っている人がいれば、ファージのコンタミを防ぐ注意が必要と思います。
バクテリアノコンタミは抗生物質で選択する限りほとんど気にすることはないと思いますし、イーストやカビは増える早さが遅いので、バクテリアのコロニーを拾うころにはまだコロニーは形成していません。

Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

Q線画培養の意味(コロニーと線の関係)

バクテリアを大量に培養する前に線画培養というものをやります。
コロニーを白金耳で線を描くように希釈して
シングルコロニーを取り出します。
線画培養をする意味が分かりません。
また、線画培養後コロニーが生えていなかった場合、
線を引いたところのやつを培養してもいいんでしょうか?

線画培養は確実にシングルコロニーを取るためにやるんでしょうか?

人によってはコロニーを突いて広げて線を引いたところを取って
大量培養する人もいます。

水滴でコロニーが混ざるといけないので
やはり線画培養をした方がいいんでしょうか?

Aベストアンサー

>線は複数のクローンが混ざっているということですか?
おっしゃるとうりです。クローンを分離しきれていません。


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