プライマーの失活

Question

TEで希釈したプライマー（原液ではなく、PCRに使用するためのプライマー・フォワードとリバースを混ぜた状態）は、4℃の条件下で失活することはあるのでしょうか？冷凍と解凍を繰り返して使用するより安全なのでしょうか？また、その際、どのくらいで失活したか、経験された方はいらっしゃいますか？

どなたか教えてください。宜しくお願いします。

lamb1204 · Accepted Answer

以前、F/Rを混ぜて保存して使ってみた同僚がいましたが、初めのうちはちゃんと増えていたのに、だんだん増えにくくなっていったという経験を見ています。ので、原理はきちんと説明できないのですが、私はやりません。

それから、質問の趣旨から外れた内容になってしまいますが、場合によってはワーキングソリューションをTEで作製するのも良くない場合があるかもしれません。もちろんプライマーの保存上はTEがいいと思いますが、PCR反応自体に影響するかもしれません。ですからストックソリューションはTEで作製し、回転の速いワーキングソリューションは水（または1/10xTEとか）で薄めて作製するのがいいのではないでしょうか。わたしは、ストックも水で作りますが、凍結融解に気をつけているので、PCRがかからなくなったという経験はありません。

tatoo · Answer

なんだか難しい感じの回答が多いですが、私は実験していて単純に次のように考えています。

PCRのPrimerを保存するのに大敵なのは、
１、凍結融解を繰り返す事によっておこる物理的なpromer DNAの破壊
２、ごくごく少量のDNaseのコンタミによるゆーっくりとした破壊
であると。

１の事を予防するために、冷凍ストックは小分けにして凍結融解とあまりしないようにする。

２は、どんなにオートクレーブした溶液（TE,水）でも操作中に、ごくごく少量のDNaseがコンタミすることがあると思います。しかし、それはごくごく少量なので、長期間、ある意味その溶液でインキュベートされないとわからないのではないでしょうか？しかもそれが４度で保存していたら、さらに長期間かもしれません。それで長い間に凍結していない場合、少しずつDNAを壊して、気がついいたらPCRのかかりが悪くなったということにつながるのではないでしょうか？F/Rを混ぜる事が原因というよりも、混ぜるという作業がコンタミをする機会を増やしていると考えられます。よって、凍結しない場合は短期間に使い切るといったことが必要かと。

noname#160718 · Answer

私も含め、ほとんどの人はフォワードとリバースのプライマーを分けて保管していると思いますが、それは別に安定性とは関係ないような気がします。
　リバースだけ少し位置を変えて設計してみたりということはわりと普通にやりますし、極端な例だと極めて変異が多い領域を増やすのに、フォワードで５種類リバースで６種類くらいのプライマーを設計して「どれか当たる組み合わせを増やす」なんてこともあったりしますから、フォワードとリバースを混合して保存すると具合が悪いですよね。
　また、ダイレクトシークエンスのプライマーもワーキングソリューション(PCRのために20pmol/uLとかに希釈して保管しているもの)から作ったりもしますから("原液"は極力融解しないように)、その時も混合していると具合が悪いです。

　なので普通はプライマーは分けて保管することがほとんどだと思いますが、用途が単一であることが明白なら混合して保存するのもありだとは思います。
　混合保存で安定性が悪くなる理由は、理屈ではちょっと思いつかないです。敢えて言えばプライマーダイマーくらいかな・・・
　でもプライマーダイマーならPCRの最初の熱変性ステップで乖離するでしょうからPCRの阻害要因になるとも思えません。なるのならそれは保存できなくプライマー設計の問題という気もします。
　でもまあ、理屈では考えられないことが多々起きるのがPCRですから、わざわざ混合プライマーを保存するという冒険をする気はあまりないですけど。でもそれで今までうまくいってるのならそれで良いのでは、というところです。

　保存方法についても、経験上はかなり雑なことをしてもあまり問題は生じていません。

　非常に頻繁に使うPCR系があり、７年の間、ずっと年に５～６回はその同じ系でRT-PCRを実施してきました。
　そのプライマーは最初に"原液"から20pmol/uLのワーキングソリューションを作ったものを７年間ず～っと使ってきたわけですが、PCRを実施する度に２～３回は凍結融解していたので７年間ではかなりの回数になると思うのですが、反応性に影響は見られませんでした。
　ちなみにポジコンに使っていたRNAも、20uLのTEにサスペンドしたものを1uLずつ使っていったのですが、使い切るまで(つまり20回ほど凍結融解したということです)反応は落ちませんでした。RNAで落ちないんだから、DNAはよほどのことがない限り大丈夫、と思っているのですが。

　ただ、別の系で2pmol/uLというかなり薄い濃度のワーキングソリューションを使わざるを得なくなっている系があるのですが、これについては使用と共にポジコンのバンドが薄くなり(これはDNA)、プライマーの活性低下(他に適当な言葉が見あたらないので活性という言葉を使いますが)を疑ったことがあります。きちんとした検証はせずじまいなんですが。

　温度については、とある研究機関を訪ねた際に、あるプライマーをワーキングソリューションで分けてもらったことがあります。まあ分けてもらうことも分けてあげることもわりとしょっちゅうあるのですが。
　ただ、たまたまジャケットのポケットに入れただけの状態で持って帰ってきて、しかもそのまま１週間ほど忘れていたということがありました。季節は秋なんですが。
　しかもそのジャケットを、プライマーをポケットに入れたまま２回ほど洗濯までしていたのですが、プライマー、ちゃんと動きました。まあさすがに作り直しはしましたが。
　まあ別にそんな横着を勧めるわけではありませんが、４℃保存か凍結融解かでそれほど悩む必要もないかな、というエピソードくらいに思っていただければ幸いです。

　ちなみに私なら凍結融解を選ぶでしょう。

MIYD · Answer

失活という表現は活性がある物質に対して使うと思いますが、
増えるかどうかと言う意味で使っているのでしょうか。

片方のプライマーだけならば、
5年以上(7年位)冷蔵で保存したプライマーで増やしたことがあります。

通常は、プライマーの安定性を重視して、フォワードとリバースを分けて小分けして冷凍保存します。
4度保温も、凍結融解も安全な操作とは言われていません。

プライマーの失活

以前、F/Rを混ぜて保存して使ってみた同僚がいましたが、初めのうちはちゃんと増えていたのに、だんだん増えにくくなっていったという経験を見ています。

なんだか難しい感じの回答が多いですが、私は実験していて単純に次のように考えています。

私も含め、ほとんどの人はフォワードとリバースのプライマーを分けて保管していると思いますが、それは別に安定性とは関係ないような気がします。

失活という表現は活性がある物質に対して使うと思いますが、

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