A 回答 (5件)
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No.5
- 回答日時:
>サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります
>200kda以上の巨大蛋白で、もともとvivoでも不安定な蛋白でそうでした。
もともと不安定なタンパク質ということなら、SDSのサンプルバッファーでどうこう言うものでは無いと思います。
もともと、SDSサンプルバッファーは、SDSをきちんとタンパク質に結合させる過程がなければ、その意味を持ちません。
そのため熱を加えたり、少なくとも室温で数時間処理するといった過程が無いと、毎回の実験ごとにSDSがタンパク質に結合する度合いが違うということになります。
No.4
- 回答日時:
>横レスになりますが、どのようなタンパク質でそういうことがあるのでしょうか?
200kda以上の巨大蛋白で、もともとvivoでも不安定な蛋白でそうでした。TCAで前処理して、プロテアーゼをより強力に不活性化しても、そうなりました。当該サンプルは、コントロールとして、10回以上しようしておりますので間違いではないでしょう。
「卵子の透明帯」については経験がありませんが、加えて、サンプルバッファーを入れないで保存できるならそれも試してみるといいでしょう。ちなみに8-9割くらいの蛋白は大丈夫かも(すべて同じ結果になる)しれません。
No.3
- 回答日時:
>まじめにやるのなら、両方試します。
サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります。非加熱のサンプルも試すといいでしょう。長年タンパク質をメインにつかった解析をしている者として、
「SDSを加える条件では」、このようなことは聞いたことありません。
横レスになりますが、どのようなタンパク質でそういうことがあるのでしょうか?
No.2
- 回答日時:
これは、対象の蛋白によるので、一般論はありません。
まじめにやるのなら、両方試します。サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります。非加熱のサンプルも試すといいでしょう。
No.1
- 回答日時:
熱を加えた後に、保存するのであれば凍結すればいいです。
ただ、次に泳動で使う場合、また熱を加えてアプライしましょう。
この辺のことは基本的な実験書に書いてあるので、
労せずやり方は手に入ると思われます。
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