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今、卵子の透明帯をSDSPAGEしようと考えています。
サンプルバッファーに試料を入れて、熱を加えた後に冷やしてサンプルインするのはわかるのですが、どの段階でストックしておくのが望ましいのでしょう?
熱を加える前に冷凍保存した方が良いのでしょうか?また熱を加えた後に、サンプルインまで凍結保存しておくのは平気でしょうか?

よろしければご教授していただければと思います。

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A 回答 (5件)

>サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります



>200kda以上の巨大蛋白で、もともとvivoでも不安定な蛋白でそうでした。

もともと不安定なタンパク質ということなら、SDSのサンプルバッファーでどうこう言うものでは無いと思います。

もともと、SDSサンプルバッファーは、SDSをきちんとタンパク質に結合させる過程がなければ、その意味を持ちません。
そのため熱を加えたり、少なくとも室温で数時間処理するといった過程が無いと、毎回の実験ごとにSDSがタンパク質に結合する度合いが違うということになります。
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>横レスになりますが、どのようなタンパク質でそういうことがあるのでしょうか?



200kda以上の巨大蛋白で、もともとvivoでも不安定な蛋白でそうでした。TCAで前処理して、プロテアーゼをより強力に不活性化しても、そうなりました。当該サンプルは、コントロールとして、10回以上しようしておりますので間違いではないでしょう。

「卵子の透明帯」については経験がありませんが、加えて、サンプルバッファーを入れないで保存できるならそれも試してみるといいでしょう。ちなみに8-9割くらいの蛋白は大丈夫かも(すべて同じ結果になる)しれません。
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>まじめにやるのなら、両方試します。

サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります。非加熱のサンプルも試すといいでしょう。

長年タンパク質をメインにつかった解析をしている者として、
「SDSを加える条件では」、このようなことは聞いたことありません。

横レスになりますが、どのようなタンパク質でそういうことがあるのでしょうか?
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これは、対象の蛋白によるので、一般論はありません。



まじめにやるのなら、両方試します。サンプルバッファーのSDSなどで完全に変性せずに不安定になるのもあります。非加熱のサンプルも試すといいでしょう。
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熱を加えた後に、保存するのであれば凍結すればいいです。



ただ、次に泳動で使う場合、また熱を加えてアプライしましょう。
この辺のことは基本的な実験書に書いてあるので、
労せずやり方は手に入ると思われます。
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