アルカリminiprep法によるプラスミド抽出の純度
こんにちは。早速質問です。
大腸菌を培養し、シーケンスのためにMini prepでプラスミドの抽出を行いました。
(マニュアルです)
その後、TEに溶解し、吸光度計を用いて、DNAの濃度と純度を測定したところ、A260/A280=1.1
とかなり純度が悪くなってしまいました。(kitと比較してです。kitでは2.0ぐらいになります)
その後、エタ沈をしてもなぜか純度は全く改善されず、A260/A280=1.1のままでした。
どのような操作に注意したらよいのでしょうか?
よろしくお願いします。
No.1ベストアンサー
- 回答日時:
ミニプレップ産物の制限酵素処理にRNase処理を組み合わせたときに、
泳動先端にRNAの分解産物が見えますか?
一般的なミニプレップキットだと、大腸菌を回収して
resuspendするバッファーにRNaseが入っていると思うのですが、
マニュアル法だとRNaseを省略している人がいる気がします。
RNaseがなければ、当然最終産物にRNAがコンタミしますので、
純度は悪くなります。
最初のバッファーにちょろっとRNase入れるだけなので、
試してみたらいかがでしょうか。
No.3
- 回答日時:
補足を追加されていたのを見たので。
RNaseは通常RNaseAを使います。
終濃度100μg/mlになるように加えてください。
もとが粉末なら、10mg/mlになるように超純水に溶かして
冷凍保存しておいて、solutionIのときに1/100vol入れればOKです。
わざわざありがとうございます。
RNaseAはキットでのプラスミド抽出に使うので、使ってみます。
ご丁寧な回答をありがとうございます。
No.2
- 回答日時:
stringf35さんがおっしゃるように、RNase処理は重要です。
RNase処理してないプラスミド溶液を泳動すると
プラスミドのバンドより下に、ボワーっと結構強くシグナルが見えます。
タンパク除去はしていますか?
エタ沈の前にフェノクロをやればもっと綺麗に取れると思います。
酵素反応をフェノールが阻害するので、フェノクロのあとに
クロロホルムイソアミルアルコールで抽出すればより安心です。
RNase処理がやはり大事みたいですね。
エタ沈をしっかりやれば除タンパクできると思ったのですが、確かにフェノクロのほうが確実ですね。ありがとうございます。
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