大学の講義でcDNAライブラリーをλファージや大腸菌を使ってcDNAを増やすというようなことを習いました。
ここで下のことがよくわかりません。
・何かの細胞or組織からmRNAを抽出して作ったものはcDNAライブラリー(それぞれが違うたんぱく質部位をコードしたcDNAの集まり)なのか、それとも同じcDNAばかりが集まったものなのか。
・cDNAライブラリーとはいろんなcDNAがごちゃまぜで保管されいるのかorあるいは何か容器ごとに「これは…のタンパク質のcDNA、これは…のタンパク質のcDNA・・・・・」というように区分けされて保管されているのか。
・ライブラリーは既知物を複製するためor未知物の配列を調べるためどちらのためにつかう物なの か?
・前者の場合どうやれば複製した既知物を単離できるのか?
つまりそもそも組織からはなんのcDNAが手に入るのかがわかりません。
またcDNAライブラリーは既知物を増やすためにライブラリーから、使うcDNAを取り出すってことなら意味はわかるのですが、未知のたんぱく質の配列を調べるためにつかうのであれば、そのたんぱく質をつくっているmRNAからcDNAなり、なんなりをつくり解析すればいいのではないでしょうか?(だから未知物解析のためならライブラリーは必要ないのではないか)
ほかにもいろいろよくわかっていないことがあるのですが、まずこんな初歩の部分ですらよくわかっていません。
解説お願いします。
A 回答 (2件)
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No.2
- 回答日時:
>何かの細胞or組織からmRNAを抽出して作ったものはcDNAライブラリー(それぞれが違うたんぱく質部位をコードしたcDNAの集まり)なのか、それとも同じcDNAばかりが集まったものなのか
前者です。それがまさにcDNAライブラリーです。
たとえば、脳からmRNAを抽出して逆転写すればbrain cDNA libraryです。
>cDNAライブラリーとはいろんなcDNAがごちゃまぜで保管されいるのかorあるいは何か容器ごとに「これは…のタンパク質のcDNA、これは…のタンパク質のcDNA・・・・・」というように区分けされて保管されているのか。
現代ではどちらもあり得ますが、教科書的にファージcDNAライブラリーという場合は、
ごちゃまぜのものをイメージすればOKです。
上の脳の例でいうと、brain cDNA library(ごちゃまぜ)をまとめてファージDNAに組み込んだものが、ファージbrain cDNA libraryです。
>ライブラリーは既知物を複製するためor未知物の配列を調べるためどちらのためにつかう物なの か?
>前者の場合どうやれば複製した既知物を単離できるのか?
どちらもあります。
欲しいcDNAがあって、単離されたものがないときは、ライブラリーからPCRで増幅できます。
増幅したcDNAを電気泳動で分離して、バンドを切り出して適当なベクターに組み込みます。
あとは大腸菌に形質転換して、目的のcDNAが入ったベクターを回収すればOKです。
未知物への応用はcDNAをそのまま使うよりも、発現クローニングの方が多いと思います。
>未知のたんぱく質の配列を調べるためにつかうのであれば、そのたんぱく質をつくっているmRNAからcDNAなり、なんなりをつくり解析すればいいのではないでしょうか?
cDNAを使わずに「そのたんぱく質をつくっているmRNA」を取るのは技術的に難しいのです。
まぁ実際問題、ポストゲノムの現代では、未知のたんぱく質の配列というのはほとんどなくて、
cDNAライブラリーはスクリーニングに応用されることがほとんどですが。
No.1
- 回答日時:
この質問に答えるには、ここではあまりに長くなりますので、
まずはこちらの書籍をご覧になったらいかがでしょうか?
http://www.shujunsha.co.jp/book/4-87962-/172-2.h …
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