大腸菌形質転換実験

大腸菌の形質転換(遺伝子組換え)実験について
学校で、大腸菌にpGLOプラスミドを導入する実験を行いました。失敗したので理由を考えています。
使用したプラスミドは、GFP(緑色蛍光タンパク質)、bla(アンピシリン耐性遺伝子)、araCが入っている教育目的でもよく行われているものです。
遺伝子組換え処理後、LB/Amp/araプレートで１日培養したところ、全面に大腸菌が生えてしまい、蛍光を発する大腸菌ができていませんでした。
それだけなら単に失敗だと思ったのですが、３日以上後に見てみると、蛍光を発するコロニーが多数できていました。
気になり、色々試したところ、アンピシリンが入っているはずのLB培地に形質転換していない大腸菌をそのままストリークしてもコロニーができることが分かりました(Ampがうまく働いていない可能性あり)。
以下の2つのことについて教えてください。

①　遺伝子組換えが成功した大腸菌を含む多数の大腸菌をアンピシリンが含まれない培地にまいた場合どうなるのか。つまり、多数の遺伝子組換えが行われていない大腸菌の中にポツンと遺伝子組換えが成功した大腸菌がある状態だと蛍光が観察できるのか。また、培養後、どのような状態になるのか。

②　アンピシリンが中途半端に効いて、大腸菌をまいた直後は全ての大腸菌が生きていて、数日してからblaを持つ大腸菌だけ生き残り、コロニーを形成するなんてことがあるのか。

上記以外にも関連しそうなことがあればお願いします。
通常なら、アンピシリンを入れたプレートをもう一度作って再実験すれば事足りるとは思うのですが、何度も再実験できる環境にないので知っている方がいれば教えてください。

No.1 ベストアンサー 回答者： 1fan9 回答日時： 2019/08/27 01:19

①遺伝子組換えが成功した大腸菌（形質転換体）を含む多数の大腸菌をアンピシリンが含まれない培地にまいた場合、形質転換体のプラスミドは維持されますが、徐々に脱落していくと予想されます。

光らない普通の大腸菌が1000匹いて、GFPを発現する遺伝子組換体の大腸菌がぽつん1匹いた場合、その集団を顕微鏡で観察すると、1000個に1個が光ります。
②それは、考えにくいと思います。大腸菌を寒天培地にまく量が多すぎたらそれに類似することは起こるかもしれません。一般的にはシングルコロニーが拾えるような濃度域で細胞をまきます。
また、形質転換はうまくいっていたが、何らかの要因で1日目にうまくGFPが検出できていなかった可能性も考えられます。

また、アンピシリンが入っているはずのLB培地に形質転換していない大腸菌をそのままストリークしてもコロニーができるというのは選択培地になっておらず、実験条件として良くないと思います。
選択培地における非形質転換体の生え方が、形質転換体より遅いなら多少選択できているとは思いますが、そうでないならアンピシリンの濃度を上げないとうまくいかないはずです。