現在in situ hybridizationを行なおうと思い、色々本を読んでますが、固定液について質問です。
成書には、とにかくRNaseフリーにするために、DEPC処理とか、乾熱滅菌とか色々書いてありますが、経験者によると、実際はそれ程気にしておらず、特にRNaseについて気にしてないようでした。
では組織が持つ内因性のRNaseはどう気をつけてるの?と聞いたら、アルデヒドで固定する為に、気にしないレベルになっていると思う、との答えでした。
さて前置きが長くなりましたが質問です。
普通in situの固定にはホルムアルデヒド固定を行い、架橋結合により併せて酵素も失活出来ると思いますが、アルコール固定のみによる変性固定では、RNaseの失活は期待できないでしょうか?
質問の意図としては、ホルムアルデヒドを作るのが面倒なのと、架橋によるプローブの浸透が阻害されるような気がするので、アルデヒド固定を省くことが出来れば、いろいろ良いことがあるんじゃないかと思ったのです。
面倒ですが、どなたか示唆を頂ければありがたいです。
No.1ベストアンサー
- 回答日時:
RNaseの最大のソースは材料の生物組織です。
それでもRNAのISHができるのは、固定によってRNaseが失活するからです。固定標本を得るまステップまではRNase-freeにこだわる必要はありませんし、その後も普通にきれいな器具、試薬を使えば組織中のRNAが分解されるほどのRNaseのコンタミはまず起こりません。ネガティブコントロールのために標本をRNase処理したものを使うという方法もありますが、なかなか効いてくれないものですよ。
アルコール固定は単なる脱水による固定なので、組織中のRNaseの失活は全く期待できません。それができるなら、RNAの取り扱いがどれだけ楽になることか。。。
ちゃんと固定をほどこした上で、界面活性剤、有機溶媒(DMSOなど)やプロテアーゼなどで処理して、プローブの浸透やターゲットRNAの暴露を高めます。
わかりにくい、変な質問に答えてくれてありがとうございました。アルコール固定のみではRNaseは失活しないのですねえ。以前何かの雑誌で(細胞工学か何か)
ISHをする時に、エタノールでエンブリオを固定して云々。。と言う記事があった記憶があって、「それは楽だなあ」と思った記憶があったんですが、やっぱり無理なんですね。
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