大腸菌に、あるタンパク質(cDNAは手元にある)を作らせたいのですが、どうやったらいいですか?
先生は「Ca溶液の中で大腸菌を洗って、氷の上において、それからああしてこうして、42℃におく」とかおっしゃってたのですが、これはDNAをどうやって組み込んでいるのでしょう?
また、たくさん発現させるには、どうしたらいいですか?

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A 回答 (3件)

ステップ1:発現プラスミドの作成


 大腸菌発現用ベクターが発売されていますので、ベクターの特定の領域(クローニングサイト)にcDNA(インサート)をいれる。
 インサートは、あらかじめPCRでつくる際にcDNAの両端(開始コドンの前と終止コドンの後ろ)に制限酵素部位をつくり、PCR後に制限酵素で切る。使う制限酵素はインサート中に切断部位がないものを使う。
 インサートと同じ制限酵素またはつなぎ目が同じ制限酵素(例:BamHIとBglII、SalIとXhoI、SmaIとEcoRVなど)でベクターのクローニングサイトを切り、インサートを入れる(ライゲーション)。
ステップ2:大腸菌で目的の発現用プラスミドを増やす
 XL1-BlueやDH5αなどの大腸菌を、先生がおっしゃったカルシウム法で処理(以下)し、ライゲーション反応終了液を加える。
<カルシウム法>
大腸菌(XL1-BlueやDH5αなど)を液体培地で一晩培養 → 液体培地で50~100倍に希釈し、一部をとって吸光度計で600nmの波長で計り、0.4~0.5位になるまで培養 → 遠心で集菌し、50~100mMの塩化カルシウムに懸濁、氷中で10分置く → 遠心し、大腸菌の沈殿に、集菌した培地量の1/10~1/20量の塩化カルシウム(同上)に懸濁 → 氷中に数時間置くと、プラスミドの導入効率が上がるが、すぐに使ってもよい → 100μlの大腸菌(塩化カルシウム中)にライゲーション反応終了液(最大10μl)を加え、氷上で30分 → 恒温水槽かヒートブロックを使い、42℃、45~90秒間熱ショックを与える → 氷に戻し2分置く → 900μlの培地を加え、37℃、1時間 → 一部(最大200μl)をプレート(プラスミドの薬剤耐性に注意して抗生物質を含む寒天培地)にまく → 37℃で一晩(16時間前後)置くと、コロニーが現れている
ステップ3:発現プラスミド回収
 コロニーをいくつかピックアップしてそれぞれ適した抗生物質を含む液体培地で一晩培養 → マニュアル法や簡便なキットを用いた方法でプラスミドを回収 → ただしくインサートが入っているか、プラスミドの一部を制限酵素で切ったり、塩基配列を調べたりする
ステップ4:発現
 タンパク質発現用の大腸菌(ベクターに合わせていろいろあります)を塩化カルシウム法で処理(ステップ2と同じ方法)でインサートが正しく入っていたプラスミドを1~10ng導入する

発現プラスミドは、ほとんどがある試薬によりインサートのタンパク質発現を誘導させるようになっていますので、それについて述べます。なぜ誘導するようになっているかというと、大腸菌にとって自分のもの以外のタンパク質を発現することはかなりの負担で、タンパク質の中には大腸菌にとって悪い影響を与える場合が多いからです。誘導に使う試薬で最も頻繁に使われるのはIPTGとよばれるものです。

 発現プラスミドを導入した発現用大腸菌コロニーをピックアップして適した抗生物質を含む液体培地で一晩培養 → 同じ培地で20~100倍に希釈して培養し、一部をとって吸光度計で600nmの波長で計り、0.5~1.0位になるまで培養 → 0.1~1.0mMIPTGを加え更に培養 → 1時間後、2時間後、...、12時間後など、いくつかの時点で一部を取ってSDS-PAGEという分析法を行います。これにより、目的のタンパク質が十分にできているかいないかがわかります。

 ご質問に、「たくさん発現させるには、どうしたらいいですか?」とありますが、発現プラスミド(ベクター)と、インサートと、大腸菌株の間で相性がりまして、たくさん発現するものから全く発現しないものまであります。経験者は試行錯誤しながらやっています。
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この回答へのお礼

おー、まさかこんなに詳しく回答していただけるとは。
大体の流れがわかりました。ありがとうございます!

お礼日時:2002/03/27 20:05

こんばんわ。


正直いって、教科書を買って下さい。
別にいじわるでいっているわけではありませんよ。
ここで十分答えられるほどかんたんではありません!

ごめんなさいね。
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この回答へのお礼

なるほどー。いいプロトコル集などご存知ですか?

お礼日時:2002/03/27 20:10

バクテリオファージのDNAに組み込み、感染させる方法や


プラスミドをベクターとして使う方法などがあります。

ファージは細菌に感染するウイルスで、細菌に感染した際、細菌の染色体DNAに取り込まれたりすることがあるのを利用します。ファージのカプシド(DNAを包む殻のようなもの)の中に組み込みたいDNAを入れて、感染させます。
一部の細菌のDNAに取り込まれ、発現するというわけです。

プラスミドとは、宿主の細胞(主として細菌)の染色体から物理的に離れていながら、安定して機能し複製する遺伝粒子で、細胞の基本的な機能にとって必須のものではないものです。また、染色体から独立して増殖することができるものです。
プラスミドについては以下のサイトで
http://members.jcom.home.ne.jp/biology/QA/items/ …
このプラスミドは大腸菌では環状のものがあります。
そのプラスミドを制限酵素で切断し、cDNAをリガーゼでくっつけます。
このような目的とするDNAを取り込ませるために使うものをベクター(運び屋)と呼びます。
塩化カルシウムの処理をした大腸菌はDNAを取り込みやすくなっており、これとベクタープラスミドを一緒に入れておきます。
すると、ベクタープラスミドが大腸菌に取り込まれます。
プラスミド上のcDNAは大腸菌の染色体DNAとは全く関係なく独立して発現され、タンパクが作られます。

たくさん発現させるにはプラスミドをPCRなどで増幅して大腸菌に取り込まれる確率を上げてやるのが良いのではないかと思われます。
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この回答へのお礼

いつもお答えありがとうございます!

お礼日時:2002/03/27 20:02

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Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

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(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

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(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

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QSDS電気泳動について教えて下さい。

SDS電気泳動ってどういうものなのでしょうか?
検索してみるとタンパク質の変性を加えて用いるということは分かったのですが、
それ以外のことは分かりません。
どなたか詳しい方教えて下さい。 

Aベストアンサー

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲルの「網目」を通過させる(大きいサイズほど流れにくく、小さいサイズのタンパク質は流れやすい)
というものです。網目を通過しやすいかしにくいかでタンパク質の長さを測定します。結果として、ゲルの下の方には小さいタンパク質が、上の方には大きいタンパク質がきます。

SDSで変性させる理由ですが、タンパク質を直鎖状にすることです。タンパク質はその機能を発揮するために特有の立体構造(疎水結合やジスルフィド結合などを利用して)を形成します。タンパク質をそのまま泳動すると、ポリアクリルアミドゲルの「網目の通りやすさ」はタンパク質の長さだけに影響されず、タンパク質の形状(立体構造)にも影響を受けます。

SDS-PAGEを行う場合の多くは、タンパク質の長さだけを知りたいので、タンパク質の立体構造に影響される電気泳動は望ましくありません。そこで、SDSでタンパク質を直鎖状にして電気泳動します。

では、SDSをいれるとなぜ、タンパク質が直鎖状になるか、です。SDSは親水基と疎水基の両方をもつ化合物です。そして、その親水基は負(マイナス)に荷電しています。

タンパク質の立体構造はアミノ酸残基(アラニン、グリシン、リジン、トリプトファン・・・)の性質(特にアミノ酸残基がもつ電荷)の影響を大きく受けます。SDSがタンパク質に作用すると、SDSの疎水基側がタンパク質に親水基側が溶媒側に結合します。このタンパク質に結合したSDSの親水基(マイナスに荷電)がタンパク質を構成する様々なアミノ酸の特性を打ち消してしまいます。結果として、SDSが結合したタンパク質はアミノ酸残基の影響をうけられなくなり直鎖状になります。

また、このようにSDSが結合したタンパク質はマイナスに荷電しますので、電気泳動をするとタンパク質(とSDSの複合体)はマイナスからプラスの方へ泳動されていきます。

最後に、立体構造に大きな影響を与えるジスルフィド結合に関してです。このジスルフィド結合はSDSによって壊されません。そこで、多くのSDS-PAGEを行う場合は、SDSと共に2-mercaptoethanolやDTTといったジスルフィド結合を壊す還元剤で処理したタンパク質を電気泳動します。

なお、立体構造も含めて解析したい場合は、Native PAGEと呼ばれる方法で電気泳動を行います。

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲ...続きを読む

Qプラスミドの形態について

大学の授業で、プラスミドにはスーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイルがあると習いました。プラスミドの形態と性質について質問があります。
(1)菌内では、本来はスーパーコイルの状態ということでした。しかし、菌体内の図は、どれを見てもプラスミドは一重の円で表示されています。これにより、本来は開環状だと思っていました。よく本に載っているこのプラスミド図示の仕方は、ただ単純に書いたために円なのでしょうか?もう少し誤解を産まない程度のスーパーコイルの表示をしないのでしょうか?

(2)プラスミドは開環状は直鎖状よりコンパクトなので、早く泳動される、と書いてある本もあれば、直鎖状の方が早く泳動されると書いてある本もありどっちが早いのか分からなくなりました。前者の理由は、直鎖の方がゲルに絡まりやすく遅くなるということでした。後者は、開環状の方が、面積が大きいからゲルに引っかかりやすく直鎖より遅くなるということでした。どちらの理由も説得力がありますます分からなくなりました。プラスミドは、開環状と直鎖状はどちらが早く泳動されるのでしょうか?また、直鎖状と開環状で流れる速度が逆になる境となるDNAの長さがあるのでしょうか?

頭がこんがらがりました。どなたかよろしくお願いします。

大学の授業で、プラスミドにはスーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイルがあると習いました。プラスミドの形態と性質について質問があります。
(1)菌内では、本来はスーパーコイルの状態ということでした。しかし、菌体内の図は、どれを見てもプラスミドは一重の円で表示されています。これにより、本来は開環状だと思っていました。よく本に載っているこのプラスミド図示の仕方は、ただ単純に書いたために円なのでしょうか?もう少し誤解を産まない程度のスーパーコイルの表示をしないのでしょうか?

(2)...続きを読む

Aベストアンサー

>スーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイル
開環状コイル、直鎖状コイルという言葉はないと思いますが(直鎖状「コイル」なんて説明している人がいるとしたら、阿呆です)。

正確には、英語ではそれぞれcovalently closed circular (ccc、またはsuper coiled)、open circular(OC)、linearといいます。環状二重鎖DNA自体がよじれて、高次構造としてコイルを作っているからあえてスーパーコイルという表現がつかわれているので、そういう高次構造をつくらない開環状や直鎖状に「コイル」をつけて使うのはナンセンスです。

>これにより、本来は開環状だと思っていました。よく本に載っているこのプラスミド図示の仕方は、ただ単純に書いたために円なのでしょうか?もう少し誤解を産まない程度のスーパーコイルの表示をしないのでしょうか?

ちょっと勉強すれば、それが単純化したschemeだということは了解しているので実際上全く問題ないとおもいますが。それより、実用上、実際上はプラスミドの一次構造(乗っている遺伝子の構造や向き)を示すために作図するので、トポロジーを保ったままである開環状で示すのは理にかなっています。

>プラスミドは開環状は直鎖状よりコンパクトなので、早く泳動される、と書いてある本もあれば、直鎖状の方が早く泳動されると書いてある本もありどっちが早いのか分からなくなりました。前者の理由は、直鎖の方がゲルに絡まりやすく遅くなるということでした。後者は、開環状の方が、面積が大きいからゲルに引っかかりやすく直鎖より遅くなるということでした。

もし、そんなことを言い切っている本があるなら(特に前者)、それはろくなものではありません。もうちょっといい教科書を読みましょうよ。どちらかというと後者の記述が正しいです。面積というかファンデルワールス体積ですかね。ゲルのメッシュの中を直鎖状は蛇のようにDNA分子の長軸に方向に潜り抜ける(そのため長いほどくぐりぬけるのが遅くなる)のにたいして開環状だとどの方向からでもメッシュに入りにくいので。

一般的にはcccがずば抜けて移動度が小さいというのは良いとしても(これもEtBr濃度などで変わる)、OCとlinearは微妙でかなり近いことが多いです。泳動の条件(エチジウムブロマイドの有無やその濃度、ゲル濃度)などによって逆転することもあるとされています。スタンダードな条件ではOCはlinearよりやや遅く、私が経験してきた中ではこれが逆転したことはありません。

>スーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイル
開環状コイル、直鎖状コイルという言葉はないと思いますが(直鎖状「コイル」なんて説明している人がいるとしたら、阿呆です)。

正確には、英語ではそれぞれcovalently closed circular (ccc、またはsuper coiled)、open circular(OC)、linearといいます。環状二重鎖DNA自体がよじれて、高次構造としてコイルを作っているからあえてスーパーコイルという表現がつかわれているので、そういう高次構造をつくらない開環状や直鎖状に「コイル」をつけて使うのはナ...続きを読む

Q原核生物と真核生物の違い

原核生物と、真核生物の違いについて教えてください(><)
また、ウイルスはどちらかも教えていただけると嬉しいです!

Aベストアンサー

【原核生物】
核膜が無い(構造的に区別出来る核を持たない)細胞(これを原核細胞という)から成る生物で、細菌類や藍藻類がこれに属する。

【真核生物】
核膜で囲まれた明確な核を持つ細胞(これを真核細胞という)から成り、細胞分裂の時に染色体構造を生じる生物。細菌類・藍藻類以外の全ての生物。

【ウイルス】
濾過性病原体の総称。独自のDNA又はRNAを持っているが、普通ウイルスは細胞内だけで増殖可能であり、ウイルス単独では増殖出来ない。



要は、核膜が有れば真核生物、無ければ原核生物という事になります。

ウイルスはそもそも細胞でなく、従って生物でもありませんので、原核生物・真核生物の何れにも属しません(一部の学者は生物だと主張しているそうですが、細胞説の定義に反する存在なので、まだまだ議論の余地は有る様です)。



こんなんで良かったでしょうか?

QゲノムDNAライブラリーとcDNAライブラリーの違い

ゲノムDNAライブラリーとcDNAライブラリーの違いって何でしょうか?

また、これらのライブラリー中にクローン化されている遺伝子の構造の大きな違いって?

よろしくお願いします

Aベストアンサー

まず、DNA=遺伝子ではないということと、「遺伝子<ゲノム」なのを考えればわかると思いますが、ゲノムライブラリーは、ゲノムを制限酵素で切断したもの全てをライブラリー化したものです。つまり、遺伝子だけでなく、遺伝子ではない部分も取り込みます。
それに対してcDNAライブラリーは、mRNAからcDNAを合成し、ライブラリー化するので、そこには、遺伝子のみが含まれます。
つまり、遺伝子のタンパク発現・機能解析を行いたい時に、cDNAライブラリーを用いる場合が多いです。
クローン化されているものに、違いはありませんよ。ミューテーションを除いて、全く同じものが複製されます。

Qヒートショックをするのには何か意味があるのでしょうか??

コンピテントセルにプラスミドDNAを取り込む実験をしていますが、極端に冷却した後、ヒートショックという過程があることをしりました。
ヒートショックをすることには、何か意味があるのでしょうか??
コンピテントセルが脆くなってDNAがさらに取り込まれやすくなったりとかするのでしょうか??

Aベストアンサー

基本的な思い違いをなされていると思います。ヒートショックによりプラスミドがコンピテントセル内に取り込まれるんです。そのため、その前段階のメルカプト添加や冷却などはコンピテントセル表面にプラスミドをくっつけヒートショックにより取り込ませやすくするための前準備という考え方が正しいです。
詳しい原理は微生物の知見がないと難しいので、脊椎動物などの遺伝研究を行っている方は意外と原理を知らなかったりします。興味があれば調べてみるといいですよ。

Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

Qタンパク質発現誘導について

大腸菌を用いての発現誘導の際にpick upしたコロニーを2×YT(+amp)につけovernightし、さらに2×YT(+amp)を加えていて、これは薄めるためにしているらしいのですが、どうして薄めるのでしょうか?

あと、そのあとにIPTGとゆう試薬を加えていて、この試薬の正体がわからないために、なんのためにこれをいれてるのかがわからなくて困っています。

どうかよろしくお願いします。

Aベストアンサー

 大腸菌はある程度増殖し細胞の密度が増してくると増殖を止めてしまいます。そのときに細胞内の状態も停止してしまいますので、タンパク合成もストップしてしまいます。そこで密度を低くして、つまり薄めることで増殖を再開させ増殖期、まあがんがん増え始めたら遺伝子発現の誘導を行って、目的のタンパク質を作らせるという為にわざわざ行っています。私が指導するとすると、朝からコロニーを培養し増殖期に入るのをまって誘導をかけるほうを選択します。どちらでもたいてい全く問題ありません。時々癖のあるタンパク質やplasmidがあって、その場合はコロニーから直接でないとampがすぐに弱ってしまって、plasmidを持たない大腸菌が大部分になってタンパク合成できない場合もありますが、Over nightで培養できる点、大腸菌の濃度が液体として薄められるので予想が立てられやすい点など、質問にあるprotocolを使う場合も少なくありません。実際には、朝9時ぐらいからある程度暖めた培地にコロニーを植えて始めれば数リットルであれば昼過ぎには(大腸菌の株によりますが)増殖期に入り始めます。あとはどのタイミングで誘導をかけるかですが、それは目的のタンパク質によります。本当はいろいろ条件決めが必要です。そうですね。。。だいたいOD600nm=0.4から0.8程度を目安にしますが、やはりODの測定器にもよりますし、もちろん目的のタンパク質、培養温度、浸透速度、培地(pHや成分など)に大きく左右されますので、あくまで目安です。
さてIPTGですが先ほどから述べていた誘導をかける試薬です。イソプロピル-β-チオガラクトピラノシドの略で様々な細菌におけるβ-ガラクトシダーゼ活性のインデューサーとして機能します。この場合ですが、大腸菌内に取り込まれラクトース類似体として機能します。具体的にはIPTGが大腸菌内のlacレプレッサーと結合することでlacオペロンをもった遺伝子に対する抑制を解除します。今回の場合は遺伝子導入されたplasmidにそれがあります。
まずはprotocolどうおりにやって目的のタンパク質が誘導されていなかったり、とっても少なかったりすれば条件をいろいろと振ってみるしか無いです。うまくいかないと大変な実験ですが、精製したタンパク質をモテるということは実験に幅が広がりますので、是非がんばってください。

 大腸菌はある程度増殖し細胞の密度が増してくると増殖を止めてしまいます。そのときに細胞内の状態も停止してしまいますので、タンパク合成もストップしてしまいます。そこで密度を低くして、つまり薄めることで増殖を再開させ増殖期、まあがんがん増え始めたら遺伝子発現の誘導を行って、目的のタンパク質を作らせるという為にわざわざ行っています。私が指導するとすると、朝からコロニーを培養し増殖期に入るのをまって誘導をかけるほうを選択します。どちらでもたいてい全く問題ありません。時々癖のあるタ...続きを読む

Qエチジウムブロマイドについて

まったくの初心者なので・・・・・。
泳動後のゲルの染色についてお尋ねしたいのですが、
アガロースゲルでDNAを泳動した後、エチジウムブロマイドで染色しようと思っています。その時のエチジウムブロマイドの適当な濃度と染色時間を知りたいです。本によって濃度が 様々であり 困ってます。
誰か教えて下さい。宜しくお願いします。

Aベストアンサー

kimwipeさんとdora1さんとほぼ同様です。私は後染めですが、EtBrは10mg/mlで遮光室温でストックしており、水200mlに2mlを加えています。別に用事調整ではなく、何度か使いまわしています(捨てるのに手間がかかりますので)。5分程度シェーカーの上で置いて、その後数回水洗いです。写真を撮る場合、キムワイプ等で水気を切ってから撮っています。ただ、すぐに撮るとバックが強く出る感じがあるので、10分程度おいてから撮っています。ただし、置きすぎるとバンドがぼけます。kimwipeさんがおっしゃるとおり、ゲルにあらかじめEtBrを加えておくと、きれいにバンドが染まるし、泳動中にUVで確認できますが、EtBrが陰極か陽極側に(忘れました)寄るので、ゲルの濃度とバンドの位置によってはバンドとバックが重なるかもしれません。

Qサテライトコロニー?について

こんばんは。
初めて質問します。よろしくお願いします。

大腸菌のトランスフォーメーション実験を行い、アンピシリンとX-gal染色によりセレクションしました。
白色コロニーをコロニーPCRにかけるために選ぶ際、指導者に、サテライトコロニー(?)は白色でも正しくトランスフォーメーションされていないことが多い、と言われました。
サテライトコロニーとは、1つの大きなコロニーのまわりに小さな飛び散ったようなコロニーが見えるもののことを指すらしいのですが。
なぜ、正しくトランスフォーメーションされていないのでしょうか?確かにコロニーPCRでは増幅されませんでした。
指導者はその理由は忘れてしまったそうです(-_-メ)
調べても中々わかりません。
どなたかご存知でしたら教えてください。
参考URLでもかまいません。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

サテライトコロニーは、形質転換体のコロニーによって、培地中の薬剤が分解されたために、形質転換されていない(つまり、プラスミドを持っていない)ものがコロニーを形成してしまう現象です。

プラスミド自体を持っていないので、β-ガラクトシダーゼ活性も持ちませんから、コロニーの色は白色となります。

ちなみに、サテライトコロニーは、アンピシリン耐性で選抜するときによく見られますが、アンピシリンの代わりにカルベニシリンという薬剤を使うと、サテライトコロニーの発生をかなり抑えられます。(カルベニシリンは、アンピシリンと比べるとかなり高価ですが。)


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