大腸菌に、あるタンパク質(cDNAは手元にある)を作らせたいのですが、どうやったらいいですか?
先生は「Ca溶液の中で大腸菌を洗って、氷の上において、それからああしてこうして、42℃におく」とかおっしゃってたのですが、これはDNAをどうやって組み込んでいるのでしょう?
また、たくさん発現させるには、どうしたらいいですか?

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A 回答 (3件)

ステップ1:発現プラスミドの作成


 大腸菌発現用ベクターが発売されていますので、ベクターの特定の領域(クローニングサイト)にcDNA(インサート)をいれる。
 インサートは、あらかじめPCRでつくる際にcDNAの両端(開始コドンの前と終止コドンの後ろ)に制限酵素部位をつくり、PCR後に制限酵素で切る。使う制限酵素はインサート中に切断部位がないものを使う。
 インサートと同じ制限酵素またはつなぎ目が同じ制限酵素(例:BamHIとBglII、SalIとXhoI、SmaIとEcoRVなど)でベクターのクローニングサイトを切り、インサートを入れる(ライゲーション)。
ステップ2:大腸菌で目的の発現用プラスミドを増やす
 XL1-BlueやDH5αなどの大腸菌を、先生がおっしゃったカルシウム法で処理(以下)し、ライゲーション反応終了液を加える。
<カルシウム法>
大腸菌(XL1-BlueやDH5αなど)を液体培地で一晩培養 → 液体培地で50~100倍に希釈し、一部をとって吸光度計で600nmの波長で計り、0.4~0.5位になるまで培養 → 遠心で集菌し、50~100mMの塩化カルシウムに懸濁、氷中で10分置く → 遠心し、大腸菌の沈殿に、集菌した培地量の1/10~1/20量の塩化カルシウム(同上)に懸濁 → 氷中に数時間置くと、プラスミドの導入効率が上がるが、すぐに使ってもよい → 100μlの大腸菌(塩化カルシウム中)にライゲーション反応終了液(最大10μl)を加え、氷上で30分 → 恒温水槽かヒートブロックを使い、42℃、45~90秒間熱ショックを与える → 氷に戻し2分置く → 900μlの培地を加え、37℃、1時間 → 一部(最大200μl)をプレート(プラスミドの薬剤耐性に注意して抗生物質を含む寒天培地)にまく → 37℃で一晩(16時間前後)置くと、コロニーが現れている
ステップ3:発現プラスミド回収
 コロニーをいくつかピックアップしてそれぞれ適した抗生物質を含む液体培地で一晩培養 → マニュアル法や簡便なキットを用いた方法でプラスミドを回収 → ただしくインサートが入っているか、プラスミドの一部を制限酵素で切ったり、塩基配列を調べたりする
ステップ4:発現
 タンパク質発現用の大腸菌(ベクターに合わせていろいろあります)を塩化カルシウム法で処理(ステップ2と同じ方法)でインサートが正しく入っていたプラスミドを1~10ng導入する

発現プラスミドは、ほとんどがある試薬によりインサートのタンパク質発現を誘導させるようになっていますので、それについて述べます。なぜ誘導するようになっているかというと、大腸菌にとって自分のもの以外のタンパク質を発現することはかなりの負担で、タンパク質の中には大腸菌にとって悪い影響を与える場合が多いからです。誘導に使う試薬で最も頻繁に使われるのはIPTGとよばれるものです。

 発現プラスミドを導入した発現用大腸菌コロニーをピックアップして適した抗生物質を含む液体培地で一晩培養 → 同じ培地で20~100倍に希釈して培養し、一部をとって吸光度計で600nmの波長で計り、0.5~1.0位になるまで培養 → 0.1~1.0mMIPTGを加え更に培養 → 1時間後、2時間後、...、12時間後など、いくつかの時点で一部を取ってSDS-PAGEという分析法を行います。これにより、目的のタンパク質が十分にできているかいないかがわかります。

 ご質問に、「たくさん発現させるには、どうしたらいいですか?」とありますが、発現プラスミド(ベクター)と、インサートと、大腸菌株の間で相性がりまして、たくさん発現するものから全く発現しないものまであります。経験者は試行錯誤しながらやっています。
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この回答へのお礼

おー、まさかこんなに詳しく回答していただけるとは。
大体の流れがわかりました。ありがとうございます!

お礼日時:2002/03/27 20:05

こんばんわ。


正直いって、教科書を買って下さい。
別にいじわるでいっているわけではありませんよ。
ここで十分答えられるほどかんたんではありません!

ごめんなさいね。
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この回答へのお礼

なるほどー。いいプロトコル集などご存知ですか?

お礼日時:2002/03/27 20:10

バクテリオファージのDNAに組み込み、感染させる方法や


プラスミドをベクターとして使う方法などがあります。

ファージは細菌に感染するウイルスで、細菌に感染した際、細菌の染色体DNAに取り込まれたりすることがあるのを利用します。ファージのカプシド(DNAを包む殻のようなもの)の中に組み込みたいDNAを入れて、感染させます。
一部の細菌のDNAに取り込まれ、発現するというわけです。

プラスミドとは、宿主の細胞(主として細菌)の染色体から物理的に離れていながら、安定して機能し複製する遺伝粒子で、細胞の基本的な機能にとって必須のものではないものです。また、染色体から独立して増殖することができるものです。
プラスミドについては以下のサイトで
http://members.jcom.home.ne.jp/biology/QA/items/ …
このプラスミドは大腸菌では環状のものがあります。
そのプラスミドを制限酵素で切断し、cDNAをリガーゼでくっつけます。
このような目的とするDNAを取り込ませるために使うものをベクター(運び屋)と呼びます。
塩化カルシウムの処理をした大腸菌はDNAを取り込みやすくなっており、これとベクタープラスミドを一緒に入れておきます。
すると、ベクタープラスミドが大腸菌に取り込まれます。
プラスミド上のcDNAは大腸菌の染色体DNAとは全く関係なく独立して発現され、タンパクが作られます。

たくさん発現させるにはプラスミドをPCRなどで増幅して大腸菌に取り込まれる確率を上げてやるのが良いのではないかと思われます。
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この回答へのお礼

いつもお答えありがとうございます!

お礼日時:2002/03/27 20:02

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Q大腸菌について。

とても初歩的なことをお尋ねさせていただきます。

・大腸菌は、もともと人間の大腸内で増殖・生存している菌なのに、それを食べてどうして病気になるのでしょうか?

・大腸菌の中で、ガスを発生するのが病原菌と聞いたことがあるのですが、ガスとは何なのでしょうか?

・一般的な菌検査では、大腸菌群(大腸菌とは関係ない??)、ガスを発生する菌か否かで検査するのでしょうか?具体的な菌名で検査しないのは、コストがかかるからでしょうか?

・食品で病原性大腸菌が発生する要因としてどんなことがあるのでしょうか?

以上ご回答のほどよろしくお願い申し上げます。

Aベストアンサー

ご職業は何でしょうか。質問者様の立場がわかるとより状況に即した回答ができると思います。
私は医師です。
・人間側の防御機構との釣り合いの問題です。細菌が優勢になると病気になります。O-157など人間にとって強烈な毒素を産生する一部の大腸菌は人間の大腸内にいません。
・その場合のガスとはCO2やH2がメインです。ガスを出さない病原性大腸菌も多くいます。
・ガスを産生する菌は大腸菌以外にもいます。ガス産生能は、菌を推定する一つの目安になります。具体的な菌名まで特定しないのは、まあ、コストというか、需要の問題です。抗菌薬治療するならもっと細かく分類が必要です。大腸菌群とは大腸の中にいる菌という意味で、大腸菌やその他の腸内細菌を含みます。
・細菌を含む生物は基本的に自然発生しません。外からの混入、増殖を減らす努力をしてください。

Q大腸菌の発現

大腸菌を用いたたんぱく質発現の方法に
Vector Immunoscreeningというのがあると思うのですが分からないので教えてください、お願いします。

Aベストアンサー

vector immunoscreeningという方法ですか?
何かの論文に載っていたのでしょうか?
もしそうだとすると前後の文章で判断できると思いますので、
補足願います。

単純に考えると。。。
大腸菌の発現系を用いてあるタンパク質を発現させるときに、
目的のタンパク質がきちんと発現している大腸菌を、
目的のタンパク質を抗原として作製した抗体を使って、
スクリーニングする方法だと思いますが。。。

自信なしです。
分かりづらい文章ですみません。

Q大腸菌operon(オペロン)について

あるウィルスのDNAに大腸菌オペロンのDNAが400bpぐらいマッチングしました。こういう場合、このウィルスは大腸菌と関係していると考えられますか。GC%が大腸菌と一致していたら大腸菌をもとにしたものと考えてもいいでしょうか。

Aベストアンサー

大腸菌の配列とウイルスの配列を比べて見ましたが、
少なくとも、現時点でNCBIからダウンロードしたデータでは
そのように100%一致する領域は見当たりませんでした。
(SARSの配列にヒットしたのは、類縁のウイルスのみでした。)

ただし、大腸菌のご指摘の領域には、ISという、移動性因子が
含まれていることが分かりました。
そこで、この領域に一致する配列をデータベースで検索
したところ、大腸菌以外に、ヒトやイネなどの配列と
されているもののいくつかにもヒットしました。
これは、おそらく、ヒトやイネなどの塩基配列を決定する操作において、
一旦大腸菌でそのDNAを増やす過程において、ISが大腸菌の
ゲノムから飛び出して、ヒトやイネのDNAを載せたプラスミドに
飛び込んでしまったためであると思われます。

したがって、これらの現象は、あくまで、配列決定操作上の
誤りであり、ヒトやイネがそのような配列のDNAを持っているという
ことではないでしょう。

>それで仮説ですが、大腸菌にバイオ操作でウィルスを感染させて利用するような技術はありますか?そうすれば大腸菌のDNAや部分的な機能が含まれたりするのではないでしょうか。

つまり、上記の様に、大腸菌にウイルスを感染させたという
わけではなく、ウイルスのゲノムDNA配列を決定するにあたり、
その一部分ごとにしたウイルスゲノムDNAを大腸菌内で
増幅させた際に生じた混入と見るのが妥当でしょう。
(もし、どこかの時点で取得して来たウイルスの配列に
大腸菌の配列が含まれていたとした場合)

ちなみに、動物に感染するウイルスを大腸菌に感染させることはできません。
大腸菌に感染するウイルスの仲間もいますが、それは、
バクテリオファージと言われるものであり、ヒトなどの
動物に感染するものとは全く違うものです。
鳥にしか感染しないはずのウイルスがヒトに感染するように
なってしまうという様なレベルの違いではないのです。

大腸菌の配列とウイルスの配列を比べて見ましたが、
少なくとも、現時点でNCBIからダウンロードしたデータでは
そのように100%一致する領域は見当たりませんでした。
(SARSの配列にヒットしたのは、類縁のウイルスのみでした。)

ただし、大腸菌のご指摘の領域には、ISという、移動性因子が
含まれていることが分かりました。
そこで、この領域に一致する配列をデータベースで検索
したところ、大腸菌以外に、ヒトやイネなどの配列と
されているもののいくつかにもヒットしました。
これは、おそら...続きを読む

Q発現用大腸菌を使ったプラスミド抽出について

BL21(DE3)株を使ったプラスミド抽出は可能でしょうか?
プラスミド抽出には、日本ジェネティクス社のFastGene Plasmid Mini Kitを使用します。

よろしくお願いします。

Aベストアンサー

プラスミドは取れると思います。ただ BL21(DE3) は RecA が潰れてないので組換えが起こりますから、導入したプラスミドとは違ったものが混ざってくるかもしれません。精製したプラスミドで何をするのかわかりませんが、サブクローニング用の大腸菌でクローニングしなおした方が良いんじゃないでしょうか。

Q大腸菌の遺伝子操作について・・・

大腸菌にプラスミドを加え形質転換させました。
最終的にLB/ampプレートに溶液をまき一日待ちました。

amp→アンピシリン(抗生物質)

大腸菌は紫外線に当てて発見できましたがこの大腸菌は最初の大腸菌と同じのができあがったと考えていいもですか?それとも違う物質なのですか?

Aベストアンサー

大腸菌をプラスミドを用いて形質転換したとき、LB/amp培地を使用したということは、そのプラスミドにはamp耐性の遺伝子が組み込まれているためです。プラスミドがうまく導入された大腸菌は(つまり、形質転換成功)amp耐性がつきますので、LB/amp培地上でも生育でき、コロニーが現れますが、プラスミドが導入されなかった大腸菌はamp耐性を持っていないため、LB/amp培地では生育できずコロニーとしては現れません。

一般的にプラスミドには抗生物質耐性の遺伝子がコードされているので、これを利用して形質転換したものとしてないものを選抜しています。最初の方のように大腸菌がもともとamp耐性を持っているとすれば、話は変わってきますが・・・。

質問の内容を見るとおそらく研究している方ではなく、大学の授業の課題のように思えます。だとすると、紫外線を当てたのは形質転換体とそうでないものを選抜する目的ではなく、形質転換後の大腸菌がどのように変わったのか(この場合、紫外線に反応する大腸菌を作出したのでは?かなり有名な遺伝子です)を見るためだと思います。

分子生物学を専攻に研究されている方にとっては、この問題はかなり基本の部分になりますが、実際に自分で体験しないと本で読むだけでは理解するのに時間がかかるのかもしれないです。今後分子生物学の分野の授業をとるとか、そちらのほうに興味があるのでしたら、本格的なものでなくても載っていると思うので、生化学の教科書等でプラスミドや形質転換について勉強されると良いですよ。

大腸菌をプラスミドを用いて形質転換したとき、LB/amp培地を使用したということは、そのプラスミドにはamp耐性の遺伝子が組み込まれているためです。プラスミドがうまく導入された大腸菌は(つまり、形質転換成功)amp耐性がつきますので、LB/amp培地上でも生育でき、コロニーが現れますが、プラスミドが導入されなかった大腸菌はamp耐性を持っていないため、LB/amp培地では生育できずコロニーとしては現れません。

一般的にプラスミドには抗生物質耐性の遺伝子がコードされているので...続きを読む

Q大腸菌でタンパク質の発現

大腸菌でタンパク質の発現させたのですが、すべて不溶性画分に発現していて、リコンビナント酵素を得ることが出来ません。これまでIPTG濃度、培養時間、コンピテントセル、ベクター等検討しましたが、だめでした。どうしたら発現しますか?pET3aで発現しなかったため、今ベクターはpColdベクターです。

Aベストアンサー

pColdを使用しているということは、培養は低温なのですね。

破砕バッファーは、いろいろ試されたのでしょうか?
バッファーのpHや、含まれる塩の濃度によってタンパク質が沈殿したり溶けたりすることがあります。

塩濃度は、一般には50~300mMのことが多いですが、0mMのときだけ可溶化するものや、反対に、1Mくらいの塩が入ってないと沈殿のものもあります。

どの条件で試すのが一番良いのかは、わかりませんが、ある程度培養条件を変えてもだめな場合は、菌の破砕条件を変えるのも一つの方法です。

Q「大腸菌群」のある食品はなぜ不衛生?

ニュースで話題になることの多い、食品中の大腸菌群なんですが、
なぜこれがあると危険なのでしょう?

大腸菌自体は体内にもあるんだし、大学で(畜産関係です)
「一度口をつけた飲み物には、口から大腸菌が入ってる」
と聞いたこともあります。
別の種類・また数の多さが問題なのでしょうか?

また、危険な菌は他にもあるのに、いつも大腸菌が問題になる気がします。
それとも、大腸菌群の有無が何かの目安になっているのでしょうか??

Aベストアンサー

大腸菌群は糞便汚染の指標とされています。
ほかには腸球菌も指標として使われます。
検出方法が簡単なことも指標として使われる1つの要因でしょう。

ちなみに、大腸菌群は必ずしも大腸菌ではありません。
畜産関係なら知ってると思いますが、一応。

Q大腸菌での組換え蛋白質の発現

分子量約100kの蛋白質をHis-tagとの融合タンパク質として
大腸菌に作らせていますが、封入体に入ってしまっているようです。
ブロットオーバーレイ(ウエストウエスタン)のプローブとして使いたいと思っています。
機能不明なので、高次構造が大事かどうかも不明ですが、
ちゃんとしてるにこした事はないと思っています。
こうゆう場合、本などを見ると、

低温で培養してみる
GST等とのfusionに変えてみる
ドメインごとに発現させる

等のことが書いてありますが、下2つは結構大変ですよね。
以上のような可溶化条件の検討に努力を費やしたほうが良いのか
それとも、尿素やグアニジン塩酸のようなもので
強引に可溶化して、リフォールディングに努力を費やした方が良いのか
教えてください。
 

Aベストアンサー

大腸菌での発現はやってみないとわからない....
というのがホントのところだと思います。
お手軽でいいんですけどねぇ。。。

以下は回答ではなく私だったら....
という提案ですので参考までに。

分子量が100kということですので、フルで発現させると
可溶性画分で回収するのは難しいのではないかと感じます。
なので、尿素やグアニジン塩酸で可溶化して、
リフォールディングを行ないつつ、
低温での培養やドメインごとの発現を同時進行します。

もしかしたら、大腸菌以外の発現系だと
あっさりといくのかもしれませんね(笑)。

Q大腸菌の生命力について。

大腸菌って、大腸から離れた場合、
どのくらいの時間生存しているのでしょうか?

よくお金は大腸菌がいっぱいついてて汚いと言いますが、
大腸菌が生きて付着しているのですか?

またネコを飼っているのですが、お尻を舐めたあと、
体も舐めています。その場合、ネコの体は「大腸菌だらけ」に
なっているのでしょうか・・・^^;)

こちらで質問するとキチンとした回答が得られると思って、
投稿させていただきました。

Aベストアンサー

O-157のような病原性大腸菌や大腸菌感染症という病気も存在しますが、一般的には大腸菌は人に悪さをする菌ではありません。

腸内細菌として糞便に含まれる事から、飲料水からは大腸菌が検出されてはいけないという決まりはあります。

ちなみに健康な人間の皮膚上から大腸菌が検出される事もあります。

お札にどの程度付着しているか、私は調べた事はありませんがお札には人間の汗、老廃物など細菌にとって栄養素となるタンパク質やアミノ酸が付着しています。

また、水分ですが人間がいう「乾いている」状態でも細菌にとっては十分生育できる湿度がある場合もあります。(カビなんかも良い例だと思います)

後は細菌が生育可能な20℃~37℃くらいの温度が有れば言い訳ですから生育は可能でしょう。

結構細菌ってあっちこっちに居ますよ。
誰もいない部屋に培地を30分くらいおいて、テストしてみるとたくさんの落下細菌が検出されたりしますから。

もし質問者さんが学生さんなら生物系の先生に頼んで実験させてもらうと良いかもしれません。

Q今、pColdベクターを用いて大腸菌でのタンパク発現を行っています。

今、pColdベクターを用いて大腸菌でのタンパク発現を行っています。
37℃から15℃に温度を下げる際、15℃以下に下げた方がよいのでしょうか。
それとも15℃に下がったらそれで良いのでしょうか。
私は今までいったん10℃前後まで下げて行っていたのですが、結構時間がかかるので、15℃になっていればそれで良いのなら、あまり温度を下げない方向で進めようかと思っているのですが。
どなたかご教授願います。

Aベストアンサー

目的が達成されているかどうかによります。

タンパクが可溶性に発現して、ちゃんと精製できるのであれば、
15℃以下に下げようが、15℃でやろうが、室温でやろうが、
どうでもいいと思います。

とはいえ、標準プロトコルは15℃だったと思うので、
なぜ10℃にしたのか理解に苦しみますが…。


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