細胞工学の課題です。
「大腸菌をどうやってクローニングしたのか」
探してみるものの、大腸菌を使ったクローニングしか出てきません。
教官はネイチャーのページや論文を調べなあかんかもしれない、といっていたけど無理です。
ネイチャーで調べたら?でした。
誰か教えてください。お願いします。

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A 回答 (1件)

以下の参考URLサイトで「大腸菌」に関する記載がありますが、もう少しどのような分野での研究を調べられるのか補足お願いします。



参考URL:http://nature.cc.hirosaki-u.ac.jp/lab/1/plantbrd …
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Q大腸菌が細胞分裂した際の細胞壁密度について

アンピシリンの作用について調べていたところ、以下ような説明がありました。

アンピシリンによって細菌細胞壁のペプチドグリカンの架橋合成が阻害される。架橋形成の阻害自体は細菌にとって毒性がないが、ペプチドグリカンの架橋阻害
により{細胞増殖の度にペプチドグリカンが薄くなる。}

ここで述べられている増殖は分裂ですよね。分裂したら、分裂まえのものと全く同じものができると思っていました。ですので、{ }内が理解できません。
基本的なことから教えていただきたいです。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

細胞が大きくなって分裂しようとしても、新たなペプチドグリカンが合成できないため(薄くなるかどうかは不明。たぶん、硬い構造のため薄くはならない。必要な部分の壁が不足する)、溶菌します。

QPCRと大腸菌クローニングの違いについて教えてください

大腸菌によるクローニングを用いた解析の流れとして,PCR-Cloning-Sequencing法があるかと思います.

シークエンスにかける前に,わざわざ大腸菌でクローニングする理由が分かりません.シークエンスにかけるため,対象DNAを増やすのであれば,そのままPCRで増やしてはダメなのでしょうか?

クローニングには対象DNAを増やす以外の何か重要な意味があるのでしょうか?(PCRにカイネティクスがある事は存じております).専門書で確認したところ,ターゲットDNAを増幅させるという意味において,広義にはPCRもクローニングの一部だと書いてありました.

すいません.素人質問で申し訳ありません.
よろしくお願い致します.

Aベストアンサー

最近のPCR用の酵素はHigh Fidelity、正確性が高くエラーは入り難いですが、PCRで酵素反応を経ただけ、エラーの確率があがります。一方、大腸菌内で増やしたものはほとんどの場合増幅によるエラーは起こりません。(条件付でいろいろな例外もありますけど)

PCR産物は得られたDNA断片の数だけ酵素反応が起こった結果の産物です。その中にはエラーの入ったものと入っていないものが混ざっています。それを鋳型にして確かに幾らでも増やせますが、状況によってはエラーが入ったものが主要成分になります。

一方、プラスミドに繋いで大腸菌に入れると、一つの細胞あたり、一個のプラスミドが増幅されます。(これも条件付ですが、最終的にそうなります)そしてシングルコロニーを拾うことをクローニングと言います。(クローニングの本来の意味と現在の適用される範囲を調べてください)

その大腸菌は欲しい配列を含んだプラスミドを維持し、増やすことが出来ます。大腸菌はグリセロールストックで半永久的に保存できます。これはプラスミドすなわち欲しい遺伝子を維持することであり、現物を大腸菌の培養のみで増幅できる状態にあります。ここには配列の情報も必要ありません。現在のように情報がどこからでも手に入る場合はこの意味が弱くなったかもしれませんが、これは今後何をするにも大変有利な状況です。

実際にPCR、ダイレクトシークエンス、ということはよくやられています。しかし、シークエンスだけがすべてではありません。

簡単に言うと便利だから、かな。

最近のPCR用の酵素はHigh Fidelity、正確性が高くエラーは入り難いですが、PCRで酵素反応を経ただけ、エラーの確率があがります。一方、大腸菌内で増やしたものはほとんどの場合増幅によるエラーは起こりません。(条件付でいろいろな例外もありますけど)

PCR産物は得られたDNA断片の数だけ酵素反応が起こった結果の産物です。その中にはエラーの入ったものと入っていないものが混ざっています。それを鋳型にして確かに幾らでも増やせますが、状況によってはエラーが入ったものが主要成分になります。

一方...続きを読む

Q大腸菌の形質転換を利用したクローニング

先日実験で、大腸菌の形質転換を利用したクローニングを行いました。

集菌と科学的処理
(1)大腸菌の培養液を氷上で冷却した。
(2)培養液5 mLを遠沈管に移し、3000 rpmで5分間遠心した。
(3)大腸菌のペレットを崩さないように上側にして、培養液の上澄みをデカントして捨てた。
(4)あらかじめ冷やしておいた形質転換用溶液(TSS)500 nLにDMSOを25 nL入れて、混ぜた。
(5)(4)を500 nL加えた。
(6)ボルテックスで穏やかに撹拌して、ペレットを縣濁した。
(7)懸濁液を100 nLずつエッペン管に分注して、形質転換に用いた。
(8)ライゲーション反応のDNA溶液を5 nL加えて、指先で軽く撹拌した。
(9)氷上に14:05~14:25頃まで放置して、DNAを取り込ませた。

寒天培地への植え継ぎ
(1)DNAを取り込ませた大腸菌に500 nLのLB培地を加えた。
(2)37℃で15~60分インキュベートして、抗生物質耐性遺伝子が活性化するのを待った。
(3)別の遠沈管に大腸菌を50 nL移し、BL培地を250 nL加えかさあげした。
(4)それぞれの遠沈管に40 nLの100 mM IPTGと40 nLの40/mL X-galを加え、軽く撹拌した。
(5)100 ng/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地2枚に、それぞれの遠沈管の大腸菌を撒いた。
(6)滅菌したスプレッダーで水気がなくなるまで満遍なく広げた。
(7)37℃の気相インキュベーターに入れて、一晩放置した。

このような手順で実験を行ったのですが、全くコロニーが出来ませんでした。
なぜでしょうか?
よろしくお願いしますm(__)m

先日実験で、大腸菌の形質転換を利用したクローニングを行いました。

集菌と科学的処理
(1)大腸菌の培養液を氷上で冷却した。
(2)培養液5 mLを遠沈管に移し、3000 rpmで5分間遠心した。
(3)大腸菌のペレットを崩さないように上側にして、培養液の上澄みをデカントして捨てた。
(4)あらかじめ冷やしておいた形質転換用溶液(TSS)500 nLにDMSOを25 nL入れて、混ぜた。
(5)(4)を500 nL加えた。
(6)ボルテックスで穏やかに撹拌して、ペレットを縣濁した。
(7)懸濁液を100 nLずつエッペン管に分注して、形質...続きを読む

Aベストアンサー

この実験はプラスミドを使用したクローニングでしょうか?私が読んで気になった事を箇条書きします、

(1)大腸菌の量は吸光度計で測定しましたか?多すぎても、低すぎてもダメです。
(2)大腸菌の培養液は10分以上と十分に冷却しましたか?
(3)ボルテックスではなく、ピペッチングでペレットを優しく撹拌して下さい。
(4)氷上でDNAを取り込ませて20分した後、42度のインキュベーターやウォーターバスで30~45秒間ぐらいの熱ショックを与え、すぐ氷上に戻して急冷してから、37度でインキュベートしましたか?
(5)X-Galの溶液は遺伝子組み換え大腸菌の培養液に加えるのではなく、同量をLB寒天培地に広げるだけで良いです。これでも十分に青色が発色します。(37度でインキュベートしている間に、行えば良いです)
(6)遺伝子組み換え大腸菌は水気がなくなるまで満遍なく広げると言うよりも、コンタミを防ぐため100μlをパッパと広げる方が良いです。

このように改善すれば、上手く行くはずです。念のため、ポジティブコントロールも同時に行う事を勧めます、(A)トランスフォーメーションだけしなかった同じ大腸菌を、抗生物質のない寒天培地にまく。
(B)切断やライゲーションを行ってないDNA断片(抗生物質耐性遺伝子やガラクトシダーゼ遺伝子のみ入っているもの)をトランスフォーメーションした大腸菌を、抗生物質の入っている寒天培地にまく。
(A)でコロニーが出来てなければ大腸菌に問題がある、(B)でコロニーが出来なければ取り込ませるDNAに問題がある、という事が分かります。
また補足質問があれば、回答します。

この実験はプラスミドを使用したクローニングでしょうか?私が読んで気になった事を箇条書きします、

(1)大腸菌の量は吸光度計で測定しましたか?多すぎても、低すぎてもダメです。
(2)大腸菌の培養液は10分以上と十分に冷却しましたか?
(3)ボルテックスではなく、ピペッチングでペレットを優しく撹拌して下さい。
(4)氷上でDNAを取り込ませて20分した後、42度のインキュベーターやウォーターバスで30~45秒間ぐらいの熱ショックを与え、すぐ氷上に戻して急冷してから、37度で...続きを読む

Q大腸菌での細胞膜タンパクを可溶性画分から回収するにはどうすればよいでしょう?

約60KDaの一回膜貫通型のタンパクをBL21で発現させようと思っています.

うちの研究室はもともと遺伝子とかタンパクには縁のない研究室なので、大腸菌およびプラスミドなどを扱っている人がおらず、独学で研究しています.
ゆえに、ほとんど人に相談することもできず四苦八苦しております(汗)

目的は、タンパクの全長かつタグフリーの状態で回収することです.

現在までにGSTタグ(pGEX)で、低温(15-25 ℃)、IPTG濃度(0.1-1 mM)などで検討を行いましたが、ほとんどがinclusion bodyに入っているようで(ウエスタンブロットで確認済み)なかなか可溶性画分から目的の回収量(できれば数 mg)に至りません.(10L cultureで200 ug程度)

また、最終的にGSTタグをグルタチオンカラムに保持した状態でのプロテアーゼによる切断を行ったのですが、どうやらタンパク質の疎水性が高いためかタンパクがロストしました.というか、膜タンパクはそもそも溶けないのでしょうか?

このような状態なのですが、なにかよい解決法があれば教えて下さい.
ちなみに、inclusion bodyからのリホールディングをスモールスケールで試してみたのですが、アルギニンと酸化型グルタチオンがないと凝集が起きやすく、またコストも馬鹿にならないように感じました.
(研究テーマが研究室のメインとはややズレており、なかなか研究費が降りないため、できうる限り低コストな策があればありがたいです)

また、目的タンパクの性質(pKa、親水性?疎水性?、立体構造など)を調べる方法やソフトがあれば教えて下さい.
ちなみに、Protein Data Bankで調べてみましたが、残念ながら登録されていないようでした.

約60KDaの一回膜貫通型のタンパクをBL21で発現させようと思っています.

うちの研究室はもともと遺伝子とかタンパクには縁のない研究室なので、大腸菌およびプラスミドなどを扱っている人がおらず、独学で研究しています.
ゆえに、ほとんど人に相談することもできず四苦八苦しております(汗)

目的は、タンパクの全長かつタグフリーの状態で回収することです.

現在までにGSTタグ(pGEX)で、低温(15-25 ℃)、IPTG濃度(0.1-1 mM)などで検討を行いましたが、ほとんどがinclusion bodyに入っているよ...続きを読む

Aベストアンサー

>10L cultureで200 ug程度

大腸菌は外来膜蛋白が嫌いです。200 ug程度は上々です。うまくいかないほうが普通です。

>どうやらタンパク質の疎水性が高いためかタンパクがロストしました.というか、膜タンパクはそもそも溶けないのでしょうか?

マイルドなデタージェントは入っていますか?NP40、Triton X-100など。どこに行ってしまったか、分解してしまったかは、チューブの壁にくっついていることも考えに入れて、SDSで洗って検討できるかもしれません。

Q大腸菌を調べる紙のなまえ

タイトルのとおりです。
サンコリテップテープですか?
また、それはどういうものですか?
詳しく書いてあるHPなどあったら教えてください!

Aベストアンサー

いろいろあります。
http://www.rabora.co.jp/rabora_002.htm
http://www3.sibata.co.jp/ssthp.nsf/da8af0043983d4e4852566ac007208b5/1f75dc798224388d49256ab2003370db?OpenDocument
http://kyoritsu-lab.co.jp/seihin/catalogue.htm
http://www.echigo.ne.jp/~miyakoya/szi04051.htm
「大腸菌群試験紙」で検索するといろいろでてきます。


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