ウエスタンブロッティング

こんにちは。早速質問です。
目的の分子量は150または80kDa、43kDaで、それぞれ7.5、10％のゲルでＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、その後200ミリアンペアで１時間、セミドライタイプで転写しています。
ところが、プレステインと、染色用マーカーがもやっとしていて特に染色用マーカーはスメアーのようになっており、目的サンプルのバンドの分子量の確認ができません。
これは何が原因なのでしょうか？？
あと、転写のアンペアは強すぎるのでしょうか？
回答よろしくお願いします。

No.1 回答者： guragura77 回答日時： 2007/10/21 15:18

スメアなのはマーカーだけなのでしょうか？

目的蛋白質のバンドは見えますか？
マーカーだけだとすると、単にマーカーの量が多過ぎるってこともあり得ると思うのですが。

転写の電流 200mA は、特に高すぎるとは思いません。転写にはバッファ組成の影響の方が大きいんじゃないかと思います。

補足要求しておいて言うのもなんですが、身近に相談できる人はいませんか？　文面より、実際の実験操作を見る方がはるかに多くのことが分かるはずです。

この回答への補足

マーカーがスメアーにもやっとしている辺りから、非特異も何もでなくなっています。
ウエスタンを開始したばかりで（10回、失敗ウエスタンですが・・・）、目的のバンドはマーカーがはっきりせずに確認できていません。
マーカーの量は３μｌ、５μｌでも同じ結果でした。

こういう場をお借りして質問させていただいているのは申し訳ないと思っているのですが、先生は恐くて質問できる雰囲気でもなく、周りは学生でウエスタン経験者がいなく、卒論のタイムリミットもあるという現状です。

補足日時：2007/10/21 18:34

No.2 回答者： geneticist12 回答日時： 2007/10/21 16:17

タンパク質が分解しているか、還元剤が劣化して還元不足になっているのではないでしょうか。

開封または調製してから長く保存した古いものではないですか。

この回答への補足

回答ありがとうございます。
新しいマーカーを使っても同じ結果でした。
流し始めははっきりマーカーはきれいにばらけていっていて、最終、ゲルの上方はバンドが見えていて、下のものほどスメアーになっているのですが、ゲルの作成、試薬に問題があるのでしょうか？

補足日時：2007/10/21 18:21

No.3 ベストアンサー 回答者： guragura77 回答日時： 2007/10/22 20:50

泳動している時からバンドがスメアになるのだとしたら、ゲルや泳動に使っているバッファのpHなども確認し直した方が良いかもしれません。

サンプルやマーカーも、還元剤を加えてもう一度ボイルしてみてはどうでしょうか。

スメアになるとしても、プレステインマーカーは見えているのですから、メンブレンとゲルを見比べれば転写の効率はおおよそ分かると思います。CBBなどで染めれば、タンパク質がメンブレン上にあるかゲルに残っているか、あるいはメンブレンを通り抜けてしまっているのかどうかがもっとよく分かると思うのですが、そういう情報をお持ちでしょうか。