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酵素溶液の保存方法について教えてください。

1.制限酵素のように、50%グリセロールの状態にし、-20℃で良いのでしょうか?
2.酵素の種類によっては、グリセロールで失活することもあるのでしょうか?

保存したい酵素はザイモリアーゼです。
よろしくお願いします。

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A 回答 (2件)

ザイモリアーゼをちょっと手元にある本で調べました。

イーストのプロトプラスト調製に使う細胞壁分解酵素のようですね。メーカーのキロンビールに直接聞くのが一番正確で早く正解が得られると思いますよ。
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この回答へのお礼

回答有難うございます。
緩衝液の問題は考えに無かったので、勉強になりました。
choleraeさんのおっしゃる通り、とりあえず試して見ようと思います。

お礼日時:2002/09/07 09:16

酵素溶液の失活の原因には主に2つあります。

1つは変性によって活性中心の構造が変化してしまうため。もうひとつは,細菌のコンタミなどによってたんぱく質そのものが分解してしてしまうため。後者の問題には,質問で触れていないので前者のみに関して回答します。
 一般的な方法としては50% glycerol存在下でマイナス20℃でよいでしょう(この条件では凍結していない)。ただし,さらに温度を下げてさらに失活を防ぐ場合と凍結することによって-20℃よりも安定性が悪くなる場合があります。それともうひとつ注意することは,保存液の緩衝液の種類や濃度です。たとえば,リン酸緩衝液などは共晶点(塩と水両方が完全に凍る温度)付近のpHが4付近になるので要注意緩衝液です。凍結速度も変性に関係します。一般には,急速凍結ー緩慢解凍がよいでしょう。
 ザイモリアーゼの経験がないので一般的なことを書きました。使用分をエッペンタイプのチューブに分注保存すると思いますが,一度,保存条件にして,1日程度経過したらアッセイしてみて保存前と比べて活性が良好ならば大丈夫でしょう。
 
 
 
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Q酵素の失活

 制限酵素やTaqなど、酵素はいつも-20℃の冷凍庫に保存していますが、なぜ室温だと失活していくのですか?プロテアーゼで切られるにしても本当にピュアなものなら大丈夫だと思いますし、活性が変わるからにはどこかしら構造が変わっているように思っているのですが・・・失活するとは酵素が何によってどのように変化しているのかが知りたいです。
 また、逆になぜ-80℃の冷蔵庫には入れないのですか?ただ-20℃で十分でそれ以上は電気代が無駄なだけだとか?
 

Aベストアンサー

遺伝子操作自体は初心者なので、適切な答えになるか分かりませんが、
蛋白質構造の研究者としての考えも含めて・・・

まず一般的に酵素試薬は、グリセロールが入っているので-20℃でも凍らないようになっています。
しかし、さらに温度を下げると凍ってしまい(グリセロールの濃度によりますが、-40℃付近以下では凍り始めるようです)、凍結により力学的に酵素が変性させられるはずです。
ですから、酵素を-80℃ディープフリーザーで保存してはいけません。
(以前そんなことを知らなかった頃に、送られてきた酵素試料をディープフリーザーで保存して危うく凍らせるところでした・・・・師匠に厳重注意されました・・(汗))

基本的に温度を下げる理由は、熱による変性防止が主な理由でしょう。
ただ、Taqのように熱に強いはずの酵素までの低温保存するのは、
おそらく、他の酵素、菌のコンタミによる分解、および酸素による酸化、などの防止であると思います。

Q制限酵素の取り扱い

制限酵素を使った実験を行いました。
多くの制限酵素は-20℃で保存されており、チューブに加える時も温度を上げないように注意されました。
しかし、最終的には37℃(酵素の至適温度)で反応させています。
制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか?失活を防ぐためですか?しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います。

また、次のような操作は可能でしょうか?
(1)チューブにDNA、制限酵素等を全て加えたところで中断して、-20℃で保存する。
(2)反応速度を上げるために、37℃で一時間のところを47℃で30分で行う。

どなたか教えて下さい。お願いします。

Aベストアンサー

>しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います
そのとおり、徐々に失活します。ですから、インキュベーションは、1‐2時間、長くても一晩ですむように酵素量を調整するのです。各制限酵素がインキュベーションの条件で、何時間後にどれだけ活性を保持するかというような情報は、試薬会社のカタログにも出ています。

>制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか
スター活性を防ぐためです。酵素は凍結防止のためグリセロール溶液で保存されて、反応液に加えても容易には拡散しません。一次的に酵素濃度と粘性が非常に高い部分ができ、非特異的な配列を切断する可能性があります。酵素を加えてよく混和するまで冷やして、反応が起こらないようにするのがよいのです。
>(2)反応速度を上げるために、37℃で一時間のところを47℃で30分で行う。
これも、スター活性の原因になり、非特異的な切断がおこる可能性があります。失活を早めることにもなります。

>(1)チューブにDNA、制限酵素等を全て加えたところで中断して、-20℃で保存する。

実際上は、いけるかもしれません。しかし、凍結してしまうと酵素は多かれ少なかれ失活するので、切断効率が起こることは覚悟しておかなければならないでしょう。

>しかし、それなら37℃では失活してしまうようにも思います
そのとおり、徐々に失活します。ですから、インキュベーションは、1‐2時間、長くても一晩ですむように酵素量を調整するのです。各制限酵素がインキュベーションの条件で、何時間後にどれだけ活性を保持するかというような情報は、試薬会社のカタログにも出ています。

>制限酵素を加える時は温度を上げないように注意するのはなぜでしょうか
スター活性を防ぐためです。酵素は凍結防止のためグリセロール溶液で保存されて、反応液に加えても容易には...続きを読む

Q酵素 失活

酵素には失活という性質があることは分かります。
温度を高くした後に冷やしても酵素が変性して酵素作用は起こらないということは参考書等で良く見かけます。また酵素はPHにも大きな影響を受けることも分かります。
ここからが質問なのですが、例えば酵素をカタラーゼとします。PHを酸性またはアルカリ性に変化させ、反応させなくさせた後に中性に戻すと失活してしまいますか?また、カタラーゼを保存するときは品質を保つ為に冷やして保存していますが、極度に低い温度の中保存したら高温の条件にして戻した時と同様に失活しますか?これらの事を参考書を読んで疑問に思ったのですが、高校3年なので勝手に実験できません。どなたか教えてください。宜しくお願いします。

Aベストアンサー

カタラーゼは凍結融解に弱い酵素として知られているので
極度に低い温度というのが溶液が凍る温度であれば再度溶かしたときに失活していますが、
溶液中の酵素全てが失活しているかについては知りません。
中には失活せずに活性のある酵素の分子もあるのかもしれません。

また、酵素によっては凍結融解を繰り返してもほとんど失活しないRNaseAのようなものもあります。
逆に冷蔵庫や冷凍庫で保存していても失活してしまう酵素もあり、-80℃で凍らせて保存して、使うときに溶かして使います。

pHによる失活は一般的には不可逆的と言われていますが、
カタラーゼがそうであるかについて私は知りません。
ゆっくりとpHを戻すことによって活性が戻るかもしれません。

http://keirinkan.com/kori/kori_chemistry/kori_chemistry_2/contents/ch-2/4-bu/4-2-1.htm

http://seibutunomu.hp.infoseek.co.jp/community1/jisshi01/3kai/3shiryou1.html

http://keirinkan.com/kori/kori_synthesis/kori_synthesis_a/contents/sy-a/1-bu/1-3-2.htm

http://www.jki.co.jp/product/f_kit/f-kit_toriatukai_main.htm

カタラーゼは凍結融解に弱い酵素として知られているので
極度に低い温度というのが溶液が凍る温度であれば再度溶かしたときに失活していますが、
溶液中の酵素全てが失活しているかについては知りません。
中には失活せずに活性のある酵素の分子もあるのかもしれません。

また、酵素によっては凍結融解を繰り返してもほとんど失活しないRNaseAのようなものもあります。
逆に冷蔵庫や冷凍庫で保存していても失活してしまう酵素もあり、-80℃で凍らせて保存して、使うときに溶かして使います。

pHによる失...続きを読む

Q吸光度計にて 石英セルとガラスセル

抽出したゲノムDNAの濃度測定にて、吸光度計を使用して吸光度を調べる実験を最近行いました。そのとき抽出して希釈したDNAを石英セルに入れたのですが、そこで先生から
「石英セル以外にガラスセルやプラスチックセルもあるのになんで石英セルを使うの?」
という質問をされ、
「屈折率の問題で石英セルが一番適しているからです。」
と答えたのですが、
「それはプラスチックだけ。なんの不純物も入ってないガラスセルなら屈折率なんて問題にならないよね?じゃあそれ以外で石英セルのほうがいい理由は?」
と言われ、そこでまったく答えらませんでした。調べたところ、ガラスより石英のほうが高価だから精密度がいい?といったものが出たのですが・・・違うようです。
なぜ、ここでは石英セルを使用するのですか?教えてください。お願いします。

Aベストアンサー

 学生時代に酵素の精製をしていて、「ゼロ合わせができません」と先生に言って大恥をかいた記憶があります。酵素ですから、測定波長は280nmです。40年も前のことですから、プラスチックセルはありません。研究上での恥のかき始めなので、今でも鮮明に覚えています。
 セルを超音波洗浄器で洗って、バラバラにしたこともあります。セルは、私にとっては、実験の最初の失敗。以後、失敗は数知れずですが、・・・。

>じゃあそれ以外で石英セルのほうがいい理由は?
正解は、「石英セルのほうがいいではなく、石英セルでないと・・・」です。
 http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/sel01.html
 石英セルは、可視部も紫外部も通します。ガラスセルでは、可視部は通すが、紫外部はほとんど通さないようです。ですから、石英セルで可視部を測るのは測定上は適正なのですが、破損の可能性を考えて(石英セルは1個1万円、ガラスセルは3000円ほどでした)、可視部はガラスセル使用というのが現実的です。
 当時は、石英セルには、セルの上部にスリガラスの線が入っているものが石英セルでした。今は違うようですが。

 「セルが壊れました」と実習学生が持ってきてくれると、『福沢諭吉がヒラヒラと飛んでいく』ことになります。貧乏な研究室の教員としては『実習をまじめにしなければ壊れることも無い』と思いつつも、顔は引きつりかけます。学生実習は、結果が分かりきっているので、当然プラスチックでしています。しかし、紫外部の測定に適したプラスチックセルは無いようで、「測定可」とした製品も文字のとおり可の状態で、石英セルのレベルではないとの業者の回答でした。

 セルで思い出すのは、吸光度を測定する2面透明のセルで蛍光を測定しているのを見ました。他の研究生の卒論生だったので、「測定するのは難しいのと違う」と声をかけましたが、その後どうしたことやら。

参考URL:http://www.fujiwara-sc.co.jp/catalog/sel01.html

 学生時代に酵素の精製をしていて、「ゼロ合わせができません」と先生に言って大恥をかいた記憶があります。酵素ですから、測定波長は280nmです。40年も前のことですから、プラスチックセルはありません。研究上での恥のかき始めなので、今でも鮮明に覚えています。
 セルを超音波洗浄器で洗って、バラバラにしたこともあります。セルは、私にとっては、実験の最初の失敗。以後、失敗は数知れずですが、・・・。

>じゃあそれ以外で石英セルのほうがいい理由は?
正解は、「石英セルのほうがいいではなく...続きを読む

Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

Qグリセロールストックについて?

学生時代、大腸菌をグリセロールストックすると保存状態が良く長期間保存できる?という事をを教わったような記憶があります。なぜ普通に凍結するより状態が良いのでしょうか?理由とグリセロールストックの操作方法を教えて下さい。又、大腸菌以外の微生物にも有効なのでしょうか?教えて下さい。お願いします

Aベストアンサー

細菌類ならなんでもできると思います。
細菌を培養した液を保存用の小さいチューブに移し、グリセロールを加えて冷凍し(液体窒素やドライアイスなどで急速冷凍するのが望ましい)、マイナス80℃のフリーザーで保存します。半永久的に保存できます。グリセロール濃度はものの本や各メーカーから提供される形によって15-50%と幅がありますが、濃度が低めのほうが再融解しにくく持ちが良いように感じます。
使用するときは、凍結したまま少量を削り取って培地にまきます。

ちなみに、生物学研究で用いられるモデル生物のひとつ、線虫もグリセロールストックします。

Q酵素活性とDTT

こんにちは。お世話になります。

ある酵素の活性を評価しているのですが、プロトコールにはDTTを入れることになっています。

1.酵素活性におけるDTTの役割は何なのでしょうか?

2.DTT入りのbufferを2週間ほど冷蔵保存して使用したところ思うような酵素活性が得られませんでした。DTTは一般に用時調製するものなのでしょうか?

3.仮に用時調製するにしても毎回微量を秤量するのは効率的ではありません。DTTの濃いstock溶液をつくり一定期間使用することは可能でしょうか?その場合、溶媒、保存方法はどうすればよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

1.酸化防止です。基本的なことですからタンパク精製の本にあると思います。ベータメルカプトエタノールも同様な働きです。

2.用事添加が基本です。察するに酸化に弱い酵素なのでしょうね。

3.1Mのストックで私は使用してます。比較的に安定です。ファイナルで1mMほどで使うことが多いので千分の一加えることになります。この場合は水で溶かせば問題ないです。別にバッファーでも問題はないと思いますけど。
使用期間ですが、実験の精度や酵素の性質によるので何ともいえません。10mlも作って分注して試されたらよろしいかと思います。

QW/V%とは?

オキシドールの成分に 過酸化水素(H2O2)2.5~3.5W/V%含有と記載されています。W/V%の意味が分かりません。W%なら重量パーセント、V%なら体積パーセントだと思いますがW/V%はどのような割合を示すのでしょうか。どなたか教えていただけないでしょうか。よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

w/v%とは、weight/volume%のことで、2.5~3.5w/v%とは、100ml中に2.5~3.5gの過酸化水素が含有されているということです。
つまり、全溶液100ml中に何gの薬液が溶けているか?
ということです。
w/v%のwはg(グラム)でvは100mlです。

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Qエクセルで計算すると2.43E-19などと表示される。Eとは何ですか?

よろしくお願いします。
エクセルの回帰分析をすると有意水準で2.43E-19などと表示されますが
Eとは何でしょうか?

また、回帰分析の数字の意味が良く分からないのですが、
皆さんは独学されましたか?それとも講座などをうけたのでしょうか?

回帰分析でR2(決定係数)しかみていないのですが
どうすれば回帰分析が分かるようになるのでしょうか?
本を読んだのですがいまいち難しくて分かりません。
教えてください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるための指数表記のことですよ。
・よって、『2.43E-19』とは?
 2.43×1/(10の19乗)で、
 2.43×1/10000000000000000000となり、
 2.43×0.0000000000000000001だから、
 0.000000000000000000243という数値を意味します。

補足:
・E+数値は 10、100、1000 という大きい数を表します。
・E-数値は 0.1、0.01、0.001 という小さい数を表します。
・数学では『2.43×10』の次に、小さい数字で上に『19』と表示します。→http://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%8C%87%E6%95%B0%E8%A1%A8%E8%A8%98
・最後に『回帰分析』とは何?下の『参考URL』をどうぞ。→『数学』カテゴリで質問してみては?

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/%E5%9B%9E%E5%B8%B0%E5%88%86%E6%9E%90

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるた...続きを読む