【免疫組織化学】同じ一次抗体、組織について複数の検出法を用いましたが結果が統一されません

Question

はじめまして。
　現在、私はマウス小腸の神経内分泌細胞に発現する【とある神経伝達物質(以後ＳやＧと略)】を検出するべく、免疫組織化学的実験法(IHC)を複数種類検討しています。
　そして、この実験中に問題が発生しました。

　検体、一次抗体が同一であれば、どのような検出法を用いても染まり方は同じですよね？？
　しかし検体、一次抗体等の条件が統一されているのにも関わらず、染まる細胞数や染まる細胞の部位が統一されません。

　検出法には、
　(1)【Alexa488標識二次抗体を用いた蛍光抗体法】
　(2)【SABC法を用いたCy3による蛍光抗体法】
　(3)【LSAB法によるDAB染色】
　をそれぞれ用いています。

　一次抗体を添加しないといったようなネガティブコントロールを確認してみても、内因性ペルオキシダーゼやビオチンによる非特異的な染色は見られません。

　私自身のIHCの技術獲得の為にも、それぞれの結果が統一できなければ、実験が先に進みません。
　IHCにお詳しい方、どうか御知恵を拝借させて下さい。
　どうかよろしくお願いいたします。

　以下、備考
・パラフィン切片
・賦活化にマイクロウェーブ
・一次抗体の濃度は一定(濃度条件検討済)

tatoo · Accepted Answer

寝ぼけて書いたところもあるかもしれません。
そのため、読みづらくて申し訳ありませんでした。

＞mRNAの発現局在について
よっぽど新規のものでないかぎり、論文でありますし。
ノーザンでも何でも発現場所が示してある論文等があるといいですね。

＞検出感度について
（３）はペルオキシダーゼという酵素が基質と反応して色が出るので、
時間が経つにつれ反応がどんどん進む（限度はありますが）と
シグナルが増強されると思いませんか？
（１）（２）は、蛍光物質がついても光るだけで増強はありません
（蛍光物質が沢山つくように工夫はされているシステムですが）。
ということと、経験上から（３）＞（２）＞（１）とあげました。
今、ふと思ったのですが、同じ数の蛍光物質があるとして、
Cy3（赤）とAlexa488（緑）ですので、赤の方が暗く見えます。
顕微鏡の性能によるところもありますが・・・
ことによると（２）＞（１）ではなく（１）＞（２）になるかもしれません。
質問者さんのそれぞれの方法で行った実験のシグナルがどのように見えているのか、
全くわからないので可能性で申し上げますが、Alexa488の像を暗くしたとこを想像するとCy3の像に見えるかも
ということなら、そういうことかもしれません。

参考までに。

tatoo · Answer

何度もすみません。ごっちゃになっていますのでこちらを

＞オートクレーブでの賦活化を使用して
検出法の違いによる検出結果の違いが生じた事はありますか？

難しい質問ですが・・・、
質問者さんが挙げられた１，２，３では、検出感度は
３＞２＞１であるので、まず私は３をやってみて、
”シグナルが強いな”と判断した場合、１（の方が好きなので）をやって結果を出してみます。
３でシグナルがもともと弱かったり、“強いと思った”けど実際は１（もしくは２）で検出するほどの強さではなかった場合は、１（もしくは２）では出ないということは結構あります。
そういう意味では、検出法の違いで検出結果の違いということになります。
一度、その抗体で条件が決まった場合には、他の条件でわざわざ確認しないので、それでどうなるかはわかりません。

tatoo · Answer

間違えました。

＞質問者さんが挙げられた１，２，３では、検出感度は
３＞２＞１であるので、まず私は１をやってみて、

正→まず私は３をやってみて、

です。

tatoo · Answer

＞レンジでの賦活化は別の因子に関して条件検討を重ね、
実験系を確率したつもりです。

免疫染色は使う一次抗体によって条件を検討しなければならないので（ほとんどは同じ条件でＯＫですが）、
別の因子に対する抗体の条件がそのまま使えるかどうかはわかりません。
抗体の希釈率などなどなど、もしも抗体のデータシートがあるのならば、
それを参考にして条件をそれぞれの抗体によって検討する必要がある時もあります。

ちなみに、話題にしたので参考までに。
私の賦活化の条件は、こちらにあるDakoのものをもとにしています。
http://products.dako.jp/site/primary/abpopup.html
私もクエン酸バッファー（自作）を用いています。トリスのほうすべからくうまくいかなかったので・・・。
本当は”温浴槽による熱処理（95℃，40分間）”をしたいのですが、この温度を保つのがほかになかったので先の回答のような条件でやっています。

＞オートクレーブでの賦活化を使用して
検出法の違いによる検出結果の違いが生じた事はありますか？

難しい質問ですが・・・、
質問者さんが挙げられた１，２，３では、検出感度は
３＞２＞１であるので、まず私は１をやってみて、
”シグナルが強いな”と判断した場合、３（の方が好きなので）をやって結果を出してみます。
１でシグナルがもともと弱かったり、“強いと思った”けど実際は３で検出するほどの強さではなかった場合は、３では出ないということは結構あります。
そういう意味では、検出法の違いで検出結果の違いということになります。
一度、その抗体で条件が決まった場合には、他の条件でわざわざ確認しないので、それでどうなるかはわかりません。

と、思いついたのですが、もし質問者さんが行っている実験で
”１ではシグナルらしきものが検出されているけど、２とか３では検出されていない”
ということであるならば、単純にある因子の発現量が低いから、
ということではないかと思います。

＞染まる細胞数や染まる細胞の部位が統一されません。
３つの検出方法で、３つともでどこかしらにシグナルっぽいのが観察されて、
そのシグナルはそれそれバラバラのところにあるということでしょうか？
一次抗体を添加しないネガコンはやってあるようですが、
例えばノーマルの血清をかけるとかいったネガコンはどうでしょうか？
単純に、抗体自体がくっつきやすいところがある可能性もあります。

どうしようもない時は・・・
私が免疫染色を行うときに、”ちゃんとしたシグナルである”ということを確信するときは、
質問者さんがやられたようなネガコンとの比較のほかに、
”少なくともmRNAの発現場所と同じである（あくまでも少なくともです）”
ということを観察して（もしくはすでに調べられた文献を参考にして）、確認します。

乱暴ですが、３つのうちmRNAの発現パターンと一致するのはこれしかないから、この検出方法が正しいという判断を下す（やるかやらないかは別として汗）ことはできるかもしれません。

思いつくままに乱文にて失礼します。

tatoo · Answer

１，２，３の方法で
１における結果はいつも同じなのでしょうか？
２における結果はいつも同じなのでしょうか？
３における結果はいつも同じなのでしょうか？

賦活化に、おそらく電子レンジをお使いだと思いますが、
私は電子レンジによる賦活化はコントロールが難しいと思ったことがあり（いつ沸騰しているかとか）、
しかし、賦活化専用の機械を買っていないので（売ってあります）、
オートクレーブで最低の温度105℃で30分間、賦活化を行っています。

これは単に、いつも同じ条件になるようにコントロールするためです。

他に何かあれば知っている限りでお答えできるかもしれません。

【免疫組織化学】同じ一次抗体、組織について複数の検出法を用いましたが結果が統一されません

寝ぼけて書いたところもあるかもしれません。

何度もすみません。

この回答への補足

間違えました。

＞レンジでの賦活化は別の因子に関して条件検討を重ね、

１，２，３の方法で

この回答への補足

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