大学生になり、生物実験でアルカリSDSを行っている者です。
アルカリSDSによるゲノムDNAとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは1本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、とありました。そしてボルテックスはsolutionIIを加えた以降は禁止で転倒混和ですが、これは激しいボルテックスによりゲノムDNAも粉々になって上清画分に出てきてしまうため、また、膜にゲノムDNAは結合していて膜とともに沈殿させることができるが、DNAが細かく切れると膜とともに沈殿させることができないため、という文もありました。疑問に思うことは以下の6つです。

(1)一本鎖になるとニックが入りやすくなるのに、プラスミドは二本鎖に戻し、ゲノムDNAを一本鎖のままにすることが、ボルテックスなどでゲノムDNAが細かくなるのを防ぎたいということと矛盾している気がします。細かくなると不都合になるのになぜわざわざ一本鎖にするのでしょうか?
(2)その後のエタ沈でDNAを沈殿させますが、一本鎖のほうが二本鎖より沈殿させやすいのしょうか?原理的にはDNAはエタノールに不溶性なため沈殿することを考えると、一本鎖でも二本鎖でも不溶性なことには違いがありませんよね?一本鎖の方がもつれて絡まりやすいから凝集するのでしょうか?
(3)ゲノムDNAは菌体の膜に結合していて一緒に沈殿しやすいというイメージがよく分からないのですが、膜に所々DNAが細胞骨格などとともに結合しているのでしょうか?何かのタンパクを介しているのでしょうか?
(4)solitionIでTris-HCl(pH.8.0)などの緩衝液を加え、菌体をボルテックスして懸濁する必要があるのは後のsolutionII以降の操作のためにどのような目的がありのでしょうか?EDTAでDNaseなどを不活性化するのは分かるのですが…。またグルコースも加えるのは何のためなのでしょう。Tris-HClで十分緩衝液になっている気がします。
(5)エタ沈の前に、フェノールクロロホルム抽出をはさむプロトコールがありました。フェノールクロロホルム抽出をはさまなくても、solutionIIのアルカリ性でタンパクは変性し、不溶性となるので、核酸と分離できるはずですが、はさむ方法もあるのは、よりタンパクを取り除くためでしょうか?
(6)こちらは、確認質問なのですが、エタ沈の目的は核酸の沈殿であって、タンパクとの分離はできませんよね?

ちまちまとすみませんが、どなたかよろしくお願いします。

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A 回答 (2件)

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。


すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、それを防ぐ為に穏やかな条件で回収しているのではないでしょうか。

(2)これはエタノール沈殿の条件では、一本鎖、二本鎖に違いはあまりないと思います。

(3)細胞質中で膜結合性タンパク質との巨大複合体として存在していると言われています。sol3の後の遠心で一緒に巻き込まれて沈殿する、というようなイメージではないでしょうか。

(4)EDTA等は、仰るようにDNAの安定化の為だと思います。
グルコースは浸透圧のコントロールとして、また後のエタノール沈殿のときにはDNAの共沈剤の効果があると言われています。浸透圧のコントロールとして塩を加えてもよいのですが、塩はDNAと不溶性複合体をつくりますので、最近のプロトコルはglucoseみたいですね(私が学生の頃はEDTA以外特になにも入っていませんでした)。後者はエタ沈の時にグリコーゲンを加える事があるのと一緒ではないでしょうか。

(5)仰るようにタンパク質を完全に除去する為です。目的によっては省略してもよいでしょう。また、フェノクロの後はフェノールを完全に除去するためにクロイソ処理が必須です。

(6)この場合のエタ沈はプラスミドDNAを単離することです。が、sol.3を回収すればタンパク質の分析も・・・できるかも。実際にQIAGENなどからは1本の培養系からDNA、RNA、タンパク質を同時に精製するkitがあります(ありました。今はちょっとわかりません)

(2)と(3)はゲノムDNAのtopologyの問題ですかね。
僕は専門ではありませんので、曖昧です。すみません。

この回答への補足

ご回答ご丁寧に、しかも早いお返事をありがとうございました。
ご回答について一つほど質問させていただきたいです。
>プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます
この文に関してなのです。DNAは二本鎖になる方が可溶性が高いのはなせでしょうか?一本鎖より二本鎖の方がリン酸基のマイナスチャージが大きいからでしょうか?
再びすみません。

補足日時:2009/05/25 21:31
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#1です。

補足です。

>>プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます
>この文に関してなのです。DNAは二本鎖になる方が可溶性が高いのはなせでしょうか?
>一本鎖より二本鎖の方がリン酸基のマイナスチャージが大きいからでしょうか?

一本鎖と二本鎖の可溶性の違いは、よくわかりません。(感触として、一本鎖DNAも普通にエタ沈してるので、そんなにかわらないんじゃないかなあ。)

プラスミドを含む小さなDNAが可溶性画分に移るというより、ゲノムの様な大きなDNAが沈殿する、というイメージです。
断片化した小さなDNAは一本鎖、二本鎖を含め、可溶性画分にコンタミする・・・と思います。

(2)はDNAの化学的性質として、(3)はゲノムのトポロジーの問題として別の質問をたててみてはどうでしょうか。
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この回答へのお礼

ご丁寧にたびたびありがとうございました。大変参考になりました。
(2)については、別の質問として出させていただこうと思います。
ありがとうございました。

お礼日時:2009/05/26 21:58

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QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

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QDNAの抽出でsolution I・II・III液は

はじめまして

大腸菌DNAの抽出でsolution I・II・III液は何のためにいれるんですか?

Aベストアンサー

微力ながら回答させて頂きます。

solutionIは懸濁液で、細胞壁を破壊します。

solutionIIは溶菌液で、菌体のタンパク質とDNAを変性させます。大腸菌が溶けるために液の濁りが消え、大腸菌のゲノムDNAとRNA、タンパク質、プラスミドDNAなどが溶け出してきます。

solutionIIIを加えると中和し、プラスミドDNAは会合して、一方でDNAやタンパク質などはSDSやカリウムと複合体を形成するので両者を分離しやすくします。

以上です。

Qプラスミドの形態について

大学の授業で、プラスミドにはスーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイルがあると習いました。プラスミドの形態と性質について質問があります。
(1)菌内では、本来はスーパーコイルの状態ということでした。しかし、菌体内の図は、どれを見てもプラスミドは一重の円で表示されています。これにより、本来は開環状だと思っていました。よく本に載っているこのプラスミド図示の仕方は、ただ単純に書いたために円なのでしょうか?もう少し誤解を産まない程度のスーパーコイルの表示をしないのでしょうか?

(2)プラスミドは開環状は直鎖状よりコンパクトなので、早く泳動される、と書いてある本もあれば、直鎖状の方が早く泳動されると書いてある本もありどっちが早いのか分からなくなりました。前者の理由は、直鎖の方がゲルに絡まりやすく遅くなるということでした。後者は、開環状の方が、面積が大きいからゲルに引っかかりやすく直鎖より遅くなるということでした。どちらの理由も説得力がありますます分からなくなりました。プラスミドは、開環状と直鎖状はどちらが早く泳動されるのでしょうか?また、直鎖状と開環状で流れる速度が逆になる境となるDNAの長さがあるのでしょうか?

頭がこんがらがりました。どなたかよろしくお願いします。

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Aベストアンサー

>スーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイル
開環状コイル、直鎖状コイルという言葉はないと思いますが(直鎖状「コイル」なんて説明している人がいるとしたら、阿呆です)。

正確には、英語ではそれぞれcovalently closed circular (ccc、またはsuper coiled)、open circular(OC)、linearといいます。環状二重鎖DNA自体がよじれて、高次構造としてコイルを作っているからあえてスーパーコイルという表現がつかわれているので、そういう高次構造をつくらない開環状や直鎖状に「コイル」をつけて使うのはナンセンスです。

>これにより、本来は開環状だと思っていました。よく本に載っているこのプラスミド図示の仕方は、ただ単純に書いたために円なのでしょうか?もう少し誤解を産まない程度のスーパーコイルの表示をしないのでしょうか?

ちょっと勉強すれば、それが単純化したschemeだということは了解しているので実際上全く問題ないとおもいますが。それより、実用上、実際上はプラスミドの一次構造(乗っている遺伝子の構造や向き)を示すために作図するので、トポロジーを保ったままである開環状で示すのは理にかなっています。

>プラスミドは開環状は直鎖状よりコンパクトなので、早く泳動される、と書いてある本もあれば、直鎖状の方が早く泳動されると書いてある本もありどっちが早いのか分からなくなりました。前者の理由は、直鎖の方がゲルに絡まりやすく遅くなるということでした。後者は、開環状の方が、面積が大きいからゲルに引っかかりやすく直鎖より遅くなるということでした。

もし、そんなことを言い切っている本があるなら(特に前者)、それはろくなものではありません。もうちょっといい教科書を読みましょうよ。どちらかというと後者の記述が正しいです。面積というかファンデルワールス体積ですかね。ゲルのメッシュの中を直鎖状は蛇のようにDNA分子の長軸に方向に潜り抜ける(そのため長いほどくぐりぬけるのが遅くなる)のにたいして開環状だとどの方向からでもメッシュに入りにくいので。

一般的にはcccがずば抜けて移動度が小さいというのは良いとしても(これもEtBr濃度などで変わる)、OCとlinearは微妙でかなり近いことが多いです。泳動の条件(エチジウムブロマイドの有無やその濃度、ゲル濃度)などによって逆転することもあるとされています。スタンダードな条件ではOCはlinearよりやや遅く、私が経験してきた中ではこれが逆転したことはありません。

>スーパーコイル、開環状コイル、直鎖状コイル
開環状コイル、直鎖状コイルという言葉はないと思いますが(直鎖状「コイル」なんて説明している人がいるとしたら、阿呆です)。

正確には、英語ではそれぞれcovalently closed circular (ccc、またはsuper coiled)、open circular(OC)、linearといいます。環状二重鎖DNA自体がよじれて、高次構造としてコイルを作っているからあえてスーパーコイルという表現がつかわれているので、そういう高次構造をつくらない開環状や直鎖状に「コイル」をつけて使うのはナ...続きを読む

QBlue-White selectionとは?

学生です。

大腸菌のpUCプラスミド等で使われる「Blue-White selection」の原理や利用目的を教えていただきたいです。

Aベストアンサー

目的のDNAをプラスミドに入れて、それを大腸菌に入れると、コロニーがたくさん生えてきます。
 コロニーの中には、目的のDNAが入っているプラスミドを持った大腸菌から成るコロニーと空のプラスミドを持った大腸菌から成るコロニーがあるはずです。
 この中から、目的のDNAが入っているプラスミドが欲しいわけですが、コロニーの外見からは区別がつかないので、当てずっぽうに何個かのコロニーから大腸菌を増やして、プラスミドDNAを調べてみないといけません。
 ここで、カラーセレクションが使えると、コロニーの色から、目的のDNAが入っているかどうかが判断できます。
 原理は、ベータガラクトシダーゼ遺伝子が入っているプラスミドは、大腸菌に入れて、基質のX-GALを加えると、酵素の働きで、コロニーが青くなります。このようなプラスミドに目的のDNAを入れると、ベータガラクトシダーゼ遺伝子が発現しなくなるので、青くなりません(白のまま)。よって、コロニーの色で、青いものは目的のDNAが入っていない、白いものは目的のDNAが入っていると、コロニーの色から判断できるのです。よって、コロニーを当てずっぽうに沢山拾わなくても、青いコロニーを避けて、白いコロニーを拾えば、目的のDNAの入ったコロニーを拾えることになります。
 クローニングサイトが、ベータガラクトシダーゼ遺伝子の中にあるために、目的のDNAが入ると、ベータガラクトシダーゼ遺伝子が分断されて、発現しなくなります。しかし、目的の遺伝子が小さいと、ちゃんとDNAが入っているにも関わらず、青のままということもあるので、注意必要です。

目的のDNAをプラスミドに入れて、それを大腸菌に入れると、コロニーがたくさん生えてきます。
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 この中から、目的のDNAが入っているプラスミドが欲しいわけですが、コロニーの外見からは区別がつかないので、当てずっぽうに何個かのコロニーから大腸菌を増やして、プラスミドDNAを調べてみないといけません。
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Qヒートショック法について

化学のカテゴリーに同様の質問をさせて頂いたのですが、もしやカテゴリー違いなのでは、と思いこちらのカテゴリーにも質問させて頂きました。

質問は、タイトルどおりです。
コンピテントセルに蛍光性タンパク質ベクターを、ヒートショック法を用いて導入しました。
このヒートショック法の機構とかいったものについて語れる方、ご教授願いたいです。

また、今回原核細胞についてヒートショック法を行ったのですが、この方法は真核細胞には適用できませんよね?そこらへんの確認と、その理由をお教え願いたいです。

Aベストアンサー

大腸菌に対しての42℃のheat shockの原理は本当のところちゃんとわかっていないじゃないでしょうか。plasmidを取り込むだけであれば、このショックは必要としません。37℃でやるヒトもいるぐらいです。
現在のようにコンピテンシーの高いコンピテントセルを作る方法論が確立されてからは、あまり重要視されていないステップかもしれません。
都市伝説に近いですが、マラリアだったか、何らかの菌は凍結保存すると休眠状態でプレートに撒いても生えてこないが、熱ショックをかけると増殖が開始するという実験方法から派生して凍結保存しているコンピテントセルにplasmidを取り込ませてから、熱をかけて刺激するという方法が採られているという説もあります。
文面から察するに温度をかけることでplasmidが取り込まれるのならば、真核培養細胞でも同様の方法はあり得るかという意味かと思いましたが、実際に大腸菌でもメンブレンをplasmidが通過するためにいろいろと工夫がなされています。どの細胞にも共通で使用される方法といえば、あえて言うなら電気穿孔法つまりエレクトロポレーション法でしょうか。
ご参考になれば幸いです。

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Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

Qアルカリ抽出法

大腸菌細胞にはプラスミドDNAと染色体が混在してるのにDNAのみが抽出されるのはどうしてでしょうか?
アルカリ抽出法ってゆーのが多分ポイントなんでしょうけどそのアルカリ抽出法がわかんないんです
アルカリ抽出法ってどんな方法なんですか?
原理など教えていただきたいです

Aベストアンサー

大腸菌は原核生物ですが、染色体ですか?ゲノムDNAの意味ですね?

アルカリやSDSで、細胞壁を破壊するんですよね。すると、溶液中に、細胞内のものがすべて溶け出して、どろどろに。

どちらかというと、直接関係あるのはその次なのではないでしょうか?高濃度の酢酸カリウム溶液(でしたっけ?)などを加えて、アルカリを中和する(ずっとアルカリだとDNAがぶちぶち切れてしまう)と共に、溶液の塩濃度をどんと上げて、タンパクなどを沈澱させるんですよね。そうすると、長鎖のゲノムDNAは、タンパクなども沢山くっついているので、巻き込まれて一緒に沈澱、一方、スーパーコイルのプラスミドは、沈澱を免れ、上清に残る、と。いかがでしょうか。

QDNAとゲノムDNAの違い

DNAとゲノムDNAの違いを教えてください。
遺伝子とDNAの違いはわかるのですが、上記の2つについてはわかりません。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

ゲノム
http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%B2%E3%83%8E%E3%83%A0

DNA
http://ja.wikipedia.org/wiki/DNA
DNAは化学的な物質名で人口に合成した化学物質でも、その化学的構造を持っていればDNAといいます。

ゲノムDNAの定義はよく分かりませんが、真核生物などはミトコンドリアなどにもDNAがあり、それと区別してゲノムDNAといえるかもしれません。また、ウイルスが感染しいて、染色体以外にDNAが存在する時、両者を区別するのにそういう表現ができると思います。


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